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1) KHK-A KO・KHK-C KO・KHK-A/C KOマウスを用いた検討
これまでにKHK-A KO・KHK-A/C KOマウスは保有している。CRISPR/Cas9システムを用いてKHK-C KOマウスを作成した。KHK-Cに特異的であるexon3cを標的とした1本のgRNAおよび2本のgRNAを用いて作成した複数のlineのマウスKHK-Cを欠損する遺伝子改変マウスについて、off targeが無いことを確認ののちコロニーを拡大し、KHKの各種splicing variantの発現系の確認および全身および各種臓器における代謝の評価のため、血液・尿・腎臓・肝臓・小腸組織をメタボローム解析に提出している。
2) マウスKHK-C antisense oligo(ASO)を作成し、DKDに対する治療効果を検討する。
KHK-A・KHK-Cはexon3のsplicing variantであり、それぞれexon3a・exon3cを有することから、exon3cを標的としたマウスKHK-C ASOを複数作成した。KHK-Cは生体内においては腎の近位尿細管に高発現するが、不死化細胞および初代培養細胞においてはその発現が低下することから、マウスKHK-C・マウスKHK-Aを強制発現するHK-2細胞株を樹立し、作成したKHK-C ASOの発現抑制効果を検討した。得られた複数のKHK-C ASOについて、KHK-Cの発現抑制は見られるものの、KHK-Aについても中等度の発現抑制がみられるなど、バリアント間の特異度が低い結果であった。またHK-2細胞におけるASOの有効性が比較的弱い結果が得られたことから、細胞腫を変更し、またsiRNAを用いる検討を開始している。DKDモデルについては、ストレプトゾトシンを用いた糖尿病モデルマウスについて、作成の準備は完了している。
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