| 研究課題/領域番号 |
18K08254
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
和田 健彦 東海大学, 医学部, 准教授 (90447409)
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| 研究分担者 |
深川 雅史 東海大学, 医学部, 教授 (00211516)
豊田 雅夫 東海大学, 医学部, 准教授 (00349383)
澤田 佳一郎 東海大学, 医学部, 客員講師 (10420952)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 糸球体足細胞 / 活性型ビタミンD / 細胞周期 / 糖尿病性腎症 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、代謝性ストレスを中心とした種々の足細胞障害性ストレスに対して、ビタミンDが最終分化段階を維持することを通じて保護作用を発揮するとの仮説を検証し、その機序を明らかにすることを目的としている。これまでに、in vivoでの検討においてparicalcitolが実際にストレプトゾトシン糖尿病マウスにおけるアルブミン尿を抑制することを観察した。また、in vitroでの検討では、温度感受性不死化マウス足細胞を分化条件で培養し、細胞障害性ストレスとしてTGF-β1やlipopolysacchalide (LPS)などを培養上清を添加、一方でvehicleまたは活性型ビタミンD（paricalcitolまたは calcitriol）も加え、足細胞における細胞周期調節蛋白の発現や、細胞骨格の変化について検討を行っている。使用している培養細胞にはビタミンD受容体が発現していることが確認されており、活性型ビタミンDの存在下で受容体の発現が誘導されることが観察された。細胞周期調節蛋白のうちp21などいくつかの分子でTGF-β1存在下で発現の変化が認められ、活性型ビタミンDはその変化を抑制する方向に作用することが見出されている。また、スリット膜関連蛋白の中にも有意な変化を呈するものがあり、その機序については今後検討する予定である。TGF-β1は培養足細胞の細胞骨格および細胞形態を変化させるが、現在phalloidin染色を用いて詳細な検討を加えている段階にある。今後、変化の見られた分子についてsiRNAなどの手法を用いて、当該分子が細胞骨格や分化状態の維持にどのように関与しているかを詳細に検討する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度は培養細胞を用いたin vitro実験で複数の活性型ビタミンD製剤と病的ストレス刺激を選択し条件検討を行ったのち、細胞周期調節蛋白・スリット膜関連分子・細胞内シグナル伝達分子についてその発現変化を検討し、ビタミンDによる足細胞保護作用に関連する可能性のある分子を選択することができた。次年度以降はその分子機序について検討を深める予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は細胞周期および分化度の検討（ウエスタンブロッティング、MTSアッセイ、スクラッチアッセイ等）および細胞骨格の詳細な検討を進めるとともに、いくつかの候補分子に絞って細胞内メカニズムの検討に移行する予定である。初年度の結果を基盤とした候補分子について、さらにmRNAレベル・蛋白レベルでの変化を複数回の実験により確認を行い、その後シグナル伝達経路をsiRNAを用いて特定の分子をノックダウンすることにより検討をする。この過程でリン酸化蛋白等に対するウエスタンブロッティングを行う。シグナル伝達経路が明らかになったところで、その増幅機構の検索を行う。その上で可能であればノックアウトマウスの作成とそれを用いたin vivoの実験による証明も行いたいと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度は培養細胞を用いた実験が多くを占め、当研究室既存の培養細胞および細胞培養用試薬、mRNA発現解析用の定量PCR用試薬（プライマーを含む）等を使用することができたため、初年度としては想定よりも少額の支出で実験を遂行することができた。
しかしながら、2019年度以降は、ウエスタンブロッティングや免疫沈降、組織染色などに用いる抗体を含む新規試薬の購入および培養細胞用試薬に多額の支出が必要であると見込まれる。
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