| 研究課題/領域番号 |
18K08275
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| 研究機関 | 大阪市立大学 |
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研究代表者 |
橋本 隆 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 特任教授 (20129597)
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| 研究分担者 |
TEYE KWESI 久留米大学, 付置研究所, 助教 (30599303)
石井 文人 久留米大学, 医学部, 准教授 (80330827)
鶴田 大輔 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (90382043)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 自己免疫性水疱症 / 水疱性類天疱瘡 / 粘膜類天疱瘡 / 免疫グロブリン / クラススイッチ / サブクラス / 免疫ブロット法 / リコンビナント蛋白 |
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| 研究実績の概要 |
各種自己免疫性水疱症における免疫グロブリンクラススイッチ過程の追跡と病原性の研究の1年目として、まず、BP180のC末端部に反応するIgG抗体とIgA抗体を同時に有する抗BP180型粘膜類天疱瘡とBP180のNC16A部位に反応するIgG抗体とIgE抗体を同時に有する水疱性類天疱瘡の血清を多数検討した。免疫ブロット法を用いた検索により、多くの抗BP180型粘膜類天疱瘡血清は、BP180のC末端部リコンビナント蛋白に反応するIgG1-IgG4サブクラス抗体とIgA1-IgA2サブクラス抗体をさまざまなパターンで有することを見出した。また、一部の水疱性類天疱瘡血清は、BP180のNC16A部位リコンビナント蛋白に反応するIgG1-IgG4サブクラス抗体とIgE抗体をさまざまなパターンで有することを見出した。
以上の結果から、まず、抗BP180型粘膜類天疱瘡とBP180のC末端部に反応することをさらに詳細に検討するため、BP180のC末端部全体をカバーする3種の小型のリコンビナント蛋白を作成し、それに対するIgG1-IgG4サブクラス抗体とIgA1-IgA2サブクラス抗体を免疫ブロット法により検討し、免疫グロブリンクラススイッチ過程を明らかにすることとした。そのため、この小型のリコンビナント蛋白を作成するためのプライマーを購入し、C末端部リコンビナント蛋白のベクターを鋳型としたPCRを施行し、得られたPCR産物をpGEX3Tベクターに挿入した。DNAシーケンシングを行い、それぞれのインサートが正しく挿入されていることを確認した。このベクターを用いて、大腸菌発現系で、リコンビナント蛋白を作成し、グルタチオンカラムを用いて蛋白を精製した。この精製したリコンビナント蛋白を用いて免疫ブロット法を施行し、想定されるサイズのリコンビナント蛋白のバンドを検出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究はほぼ予定通りに進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度に作成したBP180のC末端部をカバーする小型のリコンビナント蛋白を用いた免疫ブロット法により、多数の抗BP180型粘膜類天疱瘡血清のIgG1-IgG4サブクラス抗体とIgA1-IgA2サブクラス抗体の反応性を検討する。その結果、もし、ある血清の異なる免疫グロブリンサブクラス抗体が同じ蛋白に反応するときは、これらの抗体は同一起源のB細胞から免疫グロブリンクラススイッチ機序によって生じる可能性が示唆される。逆に、ある血清の異なる免疫グロブリンサブクラス抗体が異なる蛋白に反応するときは、これらの抗体は異なったB細胞により産生される可能性が示唆される。
同時に、BP180のNC16A部位をカバーする数種の小型のペプチドを合成する。これらを用いたELISA法により、BP180のNC16A部位リコンビナント蛋白に反応するIgG抗体とIgE抗体を同時に有する水疱性類天疱瘡血清を検討し、IgG1-IgG4サブクラス抗体とIgE抗体の反応性を検討する。その結果から、これらの血清に存在するIgG抗体とIgE抗体が、同一起源のB細胞から免疫グロブリンクラススイッチ機序によって生じたか、あるいは、異なったB細胞により産生されたかを検討する。
さらに、IgG抗体とIgA抗体を同時に有する抗BP180型粘膜類天疱瘡患者とIgG抗体とIgE抗体を同時に有する水疱性類天疱瘡患者の血液からB細胞を単離し、それぞれの免疫グロブリンクラスを特異的に増幅するプライマーを用いたPCRにより増幅し、ファージディスプレイ法を用いて各種自己抗原に対するモノクローナル抗体をスクリーニングする。その可変領域遺伝子をDNAシーケンシングにより解析することにより、異なったクラスの抗体が免疫グロブリンクラススイッチ機序によって生じたか否かを確認する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
30年度の研究において、各種のモノクローナル抗体や免疫ブロット法の試薬などを購入する予定であったが、研究室に保存してある抗体や試薬で十分に実験を進めることができたため、研究費の残額が生じた。また、次年度に、B細胞単離、ファージディスプレイライブラリー作成、DNAシーケンシングなどの実験に高額の費用がかかるため、そちらに使うために、次年度に残す必要があった。以上の理由から、643,696円の残額が生じた。
本年度は、前年度同様に、各種免疫グロブリンサブクラス抗体を用いた免疫ブロット法を施行するとともに、ペプチドの合成、B細胞単離、ファージディスプレイライブラリー作成、DNAシーケンシングなどの実験に、前年度の残額を含めた、研究費を全額使用する予定である。
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