| 研究課題/領域番号 |
18K08310
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
梅垣 知子 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (80397629)
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| 研究分担者 |
久保 亜紀子 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 特任助教 (50455573)
久保 亮治 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 准教授 (70335256)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | CHILD症候群 / NSDHL / モデルマウス |
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| 研究実績の概要 |
CHILD症候群モデルマウス(K14-CreERT-NSDHL+/--CD1a-tg)の作成
① CRISPR/Cas9システムを用いたNSDHLターゲッティングベクターの作成
X染色体上NSDHLのexon3の前後2箇所に、CRISPR/Cas9システムを用いてLoxPを挿入してターゲッティングベクターを作成した。CRISPR/Cas9用のガイドRNA選別のためにルシフェラーゼアッセイを行い、ルシフェラーゼ活性の高いガイドRNAを用いた。
② Tam誘導性-表皮特異的NSDHLコンディショナルノックアウトマウス(K14-CreERT-NSDHLflox)の作成
マウスES細胞に①で作成したNSDHLターゲッティングベクターをエレクトロポレーションにて導入し、コロニーのピックアップを行った。ES細胞のスクリーニング後、胚盤胞(BALB/c)への注入を行い、NSDHLキメラマウスを作成した。ES細胞(毛が黒色)とホスト胚（BALB/c）（アルピノ）とのキメラF1マウス（♂）と、B6（黒色）マウスと交配し、黒色のF２マウス♀5匹について、ジェノタイピングを行った。キメラマウスの尾からCica GeneusトータルDNAプレップキットを用いてDNAを抽出した。さらにターゲットベクターを挟むように数カ所primerを設定してPCRを行い、ジェノタイプを確認した。今後、NSDHLキメラマウスとK14-CreERTを掛け合わせて雄のX染色体にNSDHL変異を持つK14-CreERT-NSDHLfloxを作成する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
NSDHLキメラマウスを作成し、ジェノタイピングにて確認できている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、NSDHLキメラマウスとK14-CreERTを掛け合わせて雄のX染色体にNSDHL変異を持つK14-CreERT-NSDHLfloxを作成する。さらに今後、NSDHLキメラマウスとK14-CreERTを掛け合わせて雄のX染色体にNSDHL変異を持つK14-CreERT-NSDHLfloxを作成する。このマウスの表現型を解析するため、マウス皮膚を表皮および真皮に分離し、ガスクロマトグラフィー(GC-MS)にて脂質の解析を行い、異常なコレステロール代謝物の蓄積を検討する。さらに、表皮および真皮のtotal RNAを回収し、RNAseqにて遺伝子プロファイルを検討する。また皮膚炎発症のメカニズムを検討するため、皮膚組織の免疫染色、末梢血および皮膚組織に浸潤している細胞のFACS解析行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
NSDHLキメラマウスとK14-CreERTを掛け合わせて雄のX染色体にNSDHL変異を持つK14-CreERT-NSDHLfloxを作成し、さらにNSDHLキメラマウスとK14-CreERTを掛け合わせて雄のX染色体にNSDHL変異を持つK14-CreERT-NSDHLfloxを作成するための費用とする。
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