| 研究課題/領域番号 |
18K08315
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| 研究機関 | 秋田大学 |
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研究代表者 |
小松 久美 (鵜生川久美) 秋田大学, 医学系研究科, 講師 (70646554)
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| 研究分担者 |
高橋 直人 秋田大学, 医学系研究科, 教授 (80344753)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ヒト赤芽球 / 脱核 / Cdc42 / CASIN（阻害剤） |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、ヒト赤芽球の脱核を不均等な細胞質分裂の一種と考え、脱核に至る細胞極性化と収縮環形成を統括的に制御するシグナルや情報伝達経路を明らかにすることを目的としている。特に、ヒト赤芽球脱核はCdc42阻害剤であるCASINによって抑制されることから、脱核時のCdc42の役割や他の分子との相互作用を明らかにすることとした。令和元年度の実績を以下に示す。
1. CASINによる赤血球前駆細胞の細胞周期への影響を検討した。CFU-Eでは、CASIN投与によりG2/M期が減少した。一方で、赤芽球では、CASIN投与による細胞周期への影響は認めなかった。
2. Cdc42阻害が、赤芽球の核局在と核放出へ与える影響を検討した。赤芽球をCASIN処理して24時間後には、コントロールと比して、核が中心にある赤芽球と、核が偏在化した赤芽球の割合が上昇し、網赤血球割合が減少していた。つまりCASINは、赤芽球脱核の最終段階である細胞の極性化と収縮環形成による核放出の両方を阻害していた。
3. 一般的にCdc42のエフェクター分子で、動原体に局在するとされるmDia3について、ヒト赤芽球で検討した。CFU-Eでは、mDia3は細胞質内の動原体と、動原体から延びる微小管の分布と同じように存在していた。赤芽球では、mDia3は細胞質内の核に片側に集積する傾向があった。また、CASIN処理をすると、mDia3はより中心体付近に島状に集積し、CASIN処理をした時のダイニンに似た分布となった。mDia3とαチュブリンやγチュブリン、ダイニンの共染色について検討したが、固定法が違うため難航している。
4. エレクトロポローション法では、GFPプラスミドベクターで赤芽球への導入効率15％前後が得られ、陽性細胞のみを分離することに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
1. mDia3と他の分子の共染色が難航し、局在観察に遅れが生じている。
2. エレクトロポローション法によるGFPプラスミドベクターの導入を試みているが、導入細胞ではコントロールであっても増殖、脱核率が、低下するため、Cdc42のノックダウンとの比較が容易ではない。
3. 固定せずに赤芽球脱核を継時的に観察するための条件検討にも時間を費やしている。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. エレクトロポローション法での、GFPプラスミドベクター導入について、赤芽球へのダメージを最小にするための条件検討を続けていく。標的蛋白導入細胞については、継時的に脱核までを観察し、増殖、脱核への影響についても検討する。
2. 阻害剤処理による蛋白質の変化を、プロテオミクス解析により網羅的に解析し、新規のCdc42情報伝達経路を同定する。同定した蛋白質の発現や細胞内局在をさらに検討する。
3. 赤芽球におけるCdc42-PI3K経路を、PI3Kの酵素反応生成物であるイノシトールリン酸の分子種を質量分析法により定量的に明らかにする。
4. Cdc42やRacが赤芽球脱核に重要な役割を果たしているのは確実であり、Cdc42やRacの下流分子として同定されている蛋白質であるWAVE、PAK、WASP、Arp2/3の発現を、mRNAおよびウエスタンブロットにて検討し、さらに共焦点顕微鏡で局在も観察する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
理由：物品購入において端数が生じたこと、造血幹細胞純化を次年度に延期したことから次年度への繰り越しが生じた。
使用計画：今後の推進方策に基づいて実験を進める。予算は抗体、ベクター構築、造血幹細胞の純化等に使用する。
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