| 研究課題/領域番号 |
18K08340
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| 研究機関 | 金沢医科大学 |
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研究代表者 |
樋口 雅也 金沢医科大学, 医学部, 教授 (50334678)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | USP10 / DNA修復 / 造血幹細胞 / 相同組換え修復 |
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| 研究実績の概要 |
USP10は造血幹細胞 (HSC)の維持に必須の脱ユビキチン化酵素である。しかしながら、HSCにおいてUSP10がいかなる蛋白を脱Ub化し、どのような分子メカニズムで機能しているかは謎のままである。本研究ではUSP10の基質蛋白を同定し、USP10によるHSC維持機構の分子メカニズムを解明する。さらに白血病幹細胞の維持におけるUSP10の機能を明らかにすることを目的とする。
USP10結合蛋白を同定するため、PAタグを付加したUSP10の安定発現株を樹立、抗PA抗体による免疫沈降を行いLC-MS/MSにより結合蛋白を同定した。そのうちのひとつであるヒストンH1はリンカーヒストンとして機能するだけでなく、DNA２重鎖切断（DSB）などのDNAダメージの際にユビキチン化され、DNA修復の最初のステップにおいて足場蛋白として機能する。そこでUSP10のDSB修復における機能を解析した。USP10-KO MEF細胞にDSBを誘導しDSBの程度をみたところ、USP10 KO MEFでは処理前からDSBが有意に高く、修復もWTに比べ遷延化していた。この現象は各種ヒト細胞株のUSP10ノックダウンでも認められた。DSB修復にはNHEJ（非相同組み換え）とHR（相同組換え）経路が存在するが、USP10はHR経路に関わっていることが、各種解析より示唆された。HR経路の異常は造血幹細胞の枯渇をもたらすことが、各種KOマウスの解析より明らかになっており、これはUSP10 KOの表現型とも一致する。
白血病幹細胞を用いた解析の予備実験として、Rosa26遺伝子座にERT2 CreをノックインしたマウスとUSP10 floxマウスを交配し、全身でUSP10をコンディショナルにKOするためのマウスを作成した。しかしTamoxifen投与によるHSCでのKOは認められなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
USP10がDNA修復経路に関わっていることが明らかとなったが、その詳しい分子メカニズムを解明するには至っていない。またKOマウスのHSCで実際にDSBが亢進しているかについても不明のままである。
Rosa26 ERT2 Creノックインマウスを用いたHSCでのUSP10のコンディショナルKOモデルを確立することができなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
USP10がどのような分子メカニズムでHR経路に関わっているかを明らかにする。現在のところUSP10がDSB部位に局在するようなデータは得られておらず、USP10がHistone H1との結合を介して作用しているモデルは否定的である。USP10がHR経路に関わる何らかの蛋白をDSB部位以外で安定化もしくは活性化している可能性が高く、今後はその基質蛋白を同定することが第一の目的となる。そのため2D-DIGEによる変動蛋白の同定や、USP10結合蛋白の同定をさらに進める予定である。
コンディショナルKOモデルの確立に関しては、Mx-1 Creマウスを用いて再度試みる予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
必要となる試薬等が十分にあったため。
今年度の物品費に充当する。
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