| 研究課題/領域番号 |
18K08340
|
|---|
| 研究機関 | 金沢医科大学 |
|---|
研究代表者 |
樋口 雅也 金沢医科大学, 医学部, 教授 (50334678)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2023-03-31
|
| キーワード | USP10 / DNA修復 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究ではUSP10の基質蛋白を同定し、USP10による造血幹細胞維持機構の分子メカニズムを解明することを目的としている。 昨年度までにKO MEFを用いた解析により、USP10はDNA2重鎖切断（DSB）修復、特に相同組み換え修復(HR)に重要であり、USP10によるProtein Phosphatase 6 (PP6) holoenzymeを介したDNA-PKcs活性の制御がDSB修復に重要であることを見出した。この過程におけるUSP10の基質蛋白を同定するため、近接依存性ビオチン標識法によるスクリーニングを計画した。USP10に融合させるビオチン化酵素としては、最近開発され、従来の酵素より特異性、標識効率が上がったAirIDを使用した。USP10のN末端側にAirIDを融合させたAirID-USP10をレンチウイルスベクターによりUSP10 KO MEFに導入した。このAirID-USP10 MEFはDSBs修復能が回復することを確認した。まず予備実験としてビオチン添加によるビオチン化蛋白の検出をアビジンによるWBで試みた。その結果、USP10特異的に多数のバンドが確認できた。さらに細胞抽出液でアビジンビーズによるプルダウンを行い、既知のUSP10結合蛋白G3BP1とPABPのWBを行ったところ、両者の存在を確認した。したがってAirID-USP10は近接する蛋白を確実にビオチン化できることが示された。続いてDSB誘導後に特異的にビオチン化されるバンドの同定を試みたが、そのようなバンドは現在の実験条件下では検出できなかった。ビオチン化蛋白の検出感度を上げるため、実験系の何らかの改良が必要である。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
計画では2021年度中に近接依存性ラベル法を用いたUSP10結合蛋白スクリーニングを質量分析により行う予定であったが、諸事情により実施できなかった。
|
| 今後の研究の推進方策 |
AirID-USP10によるビオチン化蛋白の検出感度を上げるため、以下の実験を検討している。1) USP10のN末欠失変異体を作成し、DSB修復に必要十分な領域を同定する。この変異体とAirIDの融合蛋白を用いることにより、より特異的にDNA修復に関わる会合蛋白が同定できる。2) MEF以外の細胞でUSP10 KOをCRISPRにより作成し、AirID-USP10を導入、ビオチン化蛋白の同定を行う。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
研究実施に遅滞が生じ、試薬等の購入が減少した。 令和4年度の物品費に充当する。
|
