PBKが骨髄腫の悪性化に寄与する作用機序の解明と治療標的分子としての可能性の検討

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K08342
• 研究機関: 愛知医科大学
• 研究代表者: 太田 明伸 愛知医科大学, 医学部, 講師 (30438048)
• 研究分担者: 武井 則雄 北海道大学, 医学研究院, 助教 (50523461) ; 花村 一朗 愛知医科大学, 医学部, 教授 (70440740)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 多発性骨髄腫 / 造腫瘍性 / PBK / トランスレーショナルリサーチ / ノックアウトマウス

研究実績の概要

研究代表者は、PBZ binding kinase（以下、PBK）が多発性骨髄腫（Multiple Myeloma、以下MM）細胞において活性化していることを見出した。
PBKの発現レベルとMM患者の生存期間が逆相関を示すことから、MM病態へのPBKの関与が示唆された。そこで、CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集法によりPBKの主要なアレル型（N107）、稀なアレル型（N107S）、喪失型（PBK-KO）の各クローンを樹立して、免疫不全マウスを用いたXenograft法により造腫瘍性を検討した。その結果、腫瘍形成能は、N107が最も高く、N107Sではやや抑制されたものの有意な差は見られなかった。また興味深いことに、PBK-KOでは腫瘍形成能が完全に失われた。
そこで、PBKがどのように造腫瘍性に関わるのかを分子生物学的な手法によって検討した。AnnexinV (AxV)/Propidium iodide（PI）二重染色法やウェスタンブロット法によって、アポトーシス解析をおこなったところ、PBK-KO細胞では野生型細胞に比べてアポトーシス細胞の有意な増加や、細胞内のアポトーシス促進因子であるCleaved Caspase-3の活性化を認めた。以上の結果から、PBKはMM細胞のアポトーシスを抑制し造腫瘍性に寄与している可能性が示唆された。
また、臓器または個体の成熟過程におけるPBK喪失の影響を調べるために、CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集を用いたPBK遺伝子破壊マウス（PBK-KOマウス）の樹立を試みた。その結果、PBKの遺伝子座のフレームシフト変異を有する遺伝子破壊個体の作出に成功した。現在、分担研究者がPBK-KOマウスにおける生化学的な性状解析を進めており、今後は表現型の解析をおこなう予定である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の研究計画にあったMM細胞株を用いた主要な実験（分子機序、薬剤感受性、分子標的剤を用いた治療実験）は、概ね終了した。また、得られたデータを収集・解析し、論文の投稿を準備中である。論文の公表は、オープンアクセス可能な雑誌とし、公表時にプレスリリースを予定している。

遺伝子破壊マウスの作出においても進展が見られた。分担研究者は遺伝子編集技術を用いて、PBKのExon3を標的としたストラテジーによってPBKの両アレルにフレームシフト変異を持つ遺伝子破壊個体を見出した。現在、当該個体に戻し交配を試みており、今後は生化学的手法を用いた表現型の解析をおこなっていくことが可能となる。
しかし、ノックアウトマウスの解析においては、生育不全や耐性致死などの予期せぬ変化が観察されることもあり、マウスの生育状況によっては解析に時間を要する可能性がある。

以上より、本研究はおおむね当初の予定に沿って進行していると考えられる。

今後の研究の推進方策

研究代表者は、MMにおけるPBKの機能解析の過程において、PBKの発現と密接な相関を示すシグナル伝達経路と新規遺伝子を発見した。今後は、MMの悪性化機構の更なる解明に向け、PBKの分子間ネットワークの解析をおこない、新たな創薬へとつなげていく方針である。

最近、LinらはPBK阻害剤であるOTS514がPBKのみならずCDK11の活性を阻害することを報告した（Lin et al, Science Advances, 2019）。この論文は、OTS514のがん治療薬としての可能性を否定する結果を示したものではないが、OTS514によるキナーゼ阻害作用は必ずしもPBK特異的ではないことを示唆している。そこで、研究代表者は、OTS514よりも特異性に優れたPBK阻害剤の開発に向けたライブラリースクリーニングアッセイの開発を検討中である。

また、本年度は分担研究者と共にPBK遺伝子破壊マウスを用いた表現型の解析を中心に行い、正常個体におけるPBKの発現分布を明らかにする予定である。

次年度使用額が生じた理由

次年度使用額が生じたのは、分担研究者の異動に伴い、当初の研究計画に若干の遅れが発生したことによるものである。研究計画の実施については滞りなく進行しており、当初予定していた2019年度の動物実験を用いた解析を本年度に繰り下げて行う予定としている。
本年度の研究費の主な用途として、①オープンアクセス誌への論文出版にかかる論文校閲費（謝金）や論文掲載費、②国際学会での学会発表に加えて、③当初の実験計画と昨年度に予定されていた遺伝子破壊マウスの個体数の維持と当該マウスを用いた表現型解析があげられる。

研究成果

• [国際共同研究] University of Washington(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: University of Washington
• [雑誌論文] Discovery of novel molecular characteristics and cellular biological properties in ameloblastoma (2020)
  • 著者名/発表者名: Kondo Sayuri、Ota Akinobu、Ono Takayuki、Karnan Sivasundaram、Wahiduzzaman Md、Hyodo Toshinori、Lutfur Rahman Md、Ito Kunihiro、Furuhashi Akifumi、Hayashi Tomio、Konishi Hiroyuki、Tsuzuki Shinobu、Hosokawa Yoshitaka、Kazaoka Yoshiaki
  • 雑誌名: Cancer Medicine 巻: 9 ページ: 2904～2917
  • DOI: 10.1002/cam4.2931
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Tandem Paired Nicking Promotes Precise Genome Editing with Scarce Interference by p53 (2020)
  • 著者名/発表者名: Hyodo Toshinori、Rahman Md. Lutfur、Karnan Sivasundaram、Ito Takuji、Toyoda Atsushi、Ota Akinobu、Wahiduzzaman Md、Tsuzuki Shinobu、Okada Yohei、Hosokawa Yoshitaka、Konishi Hiroyuki
  • 雑誌名: Cell Reports 巻: 30 ページ: 1195～1207.e7
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2019.12.064
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Novel mechanistic insights into the anti-cancer mode of arsenic trioxide (2020)
  • 著者名/発表者名: Wahiduzzaman M, Ota A, Hosokawa Y.
  • 雑誌名: Current Cancer Drug Targets 巻: 20(2) ページ: 115-129
  • DOI: 10.2174/1568009619666191021122006
  • 査読あり
• [雑誌論文] Bi-allelic loss of FAM46C triggers tumor growth with concomitant activation of Akt signaling in multiple myeloma cells (2020)
  • 著者名/発表者名: Kanasugi J, Hanamura I, Ota A, Karnan S, Vu LQ, Mizuno S, Wahiduzzaman M, Rahman ML, Hyodo T, Konishi H, Tsuzuki S, Hosokawa Y, Takami A
  • 雑誌名: Cancer Science 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1111/cas.14386
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Interferon-γ-induced HLA Class II expression on endothelial cells is decreased by inhibition of mTOR and HMG-CoA reductase (2020)
  • 著者名/発表者名: Maenaka A, Kenta I, Ota A, Miwa Y, Ohashi W, Horimi K, Matsuoka Y, Ohnishi M, Uchida K, Kobayashi T
  • 雑誌名: FEBS Open Bio 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1002/2211-5463.12854
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 多発性骨髄腫の進展に関わる分子機構とPBKの関与 (2019)
  • 著者名/発表者名: 太田 明伸, 花村 一朗
  • 雑誌名: BIO Clinica 巻: 34(6) ページ: 86－92
• [雑誌論文] ゲノム編集法を用いた骨髄腫の悪性化に関わる分子機構の解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 太田 明伸, 細川好孝
  • 雑誌名: Medical Science Digest 巻: 45(9) ページ: 8-11
• [雑誌論文] 多発性骨髄腫におけるPBK 発現の意義と 治療標的としての可能性 (2019)
  • 著者名/発表者名: 太田明伸，花村一朗，細川好孝
  • 雑誌名: BIO Clinica 巻: 34(13) ページ: 65-69
• [雑誌論文] Establishment of a mouse model for injury-induced scar formation and the accompanying chronic pain: Comprehensive microarray analysis of molecular expressions in fibrosis and hyperalgesia. (2019)
  • 著者名/発表者名: Li Y, Iida H, Kimata K, Zhuo L, Ota A, Kimura S, Yin X, Deie M, Ushida T.
  • 雑誌名: Molecular Pain 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1177/1744806919892389
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 骨髄腫細胞におけるPBZ binding kinaseの腫瘍促進作用と治療標的分子としての可能性 (2019)
  • 著者名/発表者名: 太田明伸、花村一朗、Karnan Sivasundaram、高見昭良、細川好孝
  • 学会等名: 第44回日本骨髄腫学会学術総会
• [学会発表] Biallelic Loss of FAM46C Promotes the Proliferation of Multiple Myeloma Cells with Concomitant Upregulation of P13K-AKT Signaling (2019)
  • 著者名/発表者名: Jo Kanasugi, Ichiro Hanamura, Akinobu Ota, Sivasundaram Karnan, Lam Quang Vu, Yoshitaka Hosokawa, Akiyoshi Takami
  • 学会等名: 第10回日本血液学会（JSH）国際シンポジウム
• [学会発表] CRISPR/Cas9 nickase によるサイレント変異不要のノックイン (2019)
  • 著者名/発表者名: 兵頭寿典、Md Lutfur Rahman、豊田敦、Sivasundaram Karnan、太田明伸、都築忍、 細川好孝、小西裕之
  • 学会等名: 第4回日本ゲノム編集学会
• [学会発表] CRISPR/Cas9 nickaseによるノックインはp53を活性化しない (2019)
  • 著者名/発表者名: 兵頭寿典、Md Lutfur Rahman、Sivasundaram Karnan、太田明伸、都築忍、細川好孝、 小西裕之
  • 学会等名: 第4回日本ゲノム編集学会
• [学会発表] Experimental conditions permitting efficient targeted koock-in using CRISPR/Cas9 nickase (2019)
  • 著者名/発表者名: Md Lutfur Rahman, Toshinori Hyodo, Sivasundaram Karnan, Akinobu Ota, Shinobu Tsuzuki, Yoshitaka Hosokawa, Hiroyuki Konishi
  • 学会等名: 第4回日本ゲノム編集学会
• [学会発表] CRISPRCas9を用いたNF2及びCDKN2Aノックアウトヒト中皮腫細胞株の樹立と分子生物学的解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: Sivasundaram Karnan, Akinobu ota, Ichiro Hanamura, Hideki Murakami, Toshinori Hyodo, Wahiduzzanan Md, Hiroyuki Konishi , Shinobu Tsuzuki, Yoshitaka Hosokawa
  • 学会等名: 第92回日本生化学会大会
• [学会発表] p16/NF2遺伝子の欠損により発現の誘導される悪性中皮腫特異的分子の同定 (2019)
  • 著者名/発表者名: シバスンダラン カルナン、太田明伸、花村一朗、村上秀樹、兵頭寿典、小西裕之、 都築忍、細川好孝
  • 学会等名: 第78回日本癌学会学術総会
• [学会発表] Chromosomal translocation t(11;14) and p53 deletion in B cell-derived iPS cells by CRISPR/Cas9 (2019)
  • 著者名/発表者名: Aki Yanagi, Naohiro Tsuyama, Misaki Sugai, Yu Abe, Yukari Yanai, Akinobu Ota, Karnan Sivasundaram, Lobna Alkebsi, Moe Muramatsu, Tomonari Shigemura, Megumi Sasatani, Yuko Hashimoto, Kenji Kamiya, Ichiro Hanamura, Takayuki Ikezoe, Masafumi Onodera, Akira Sakai.
  • 学会等名: 第81回日本血液学会学術集会
• [学会発表] Tandem paired nicking using Cas9 nickases permits targeted knock-in without significant inhibition by p53 (2019)
  • 著者名/発表者名: Toshinori Hyodo, Md Lutfur Rahman, Atsushi Toyoda, Sivasundaram Karnan, Akinobu Ota, Shinobu Tuzuki, Yoshitaka Hosokawa, Hiroyuki Konishi
  • 学会等名: Frontiers in Genome Engineering 2019
  • 国際学会
• [学会発表] DNA二重鎖切断を介さない変異ノックイン法（Targeted knock-in without introducing double-stranded DNA breaks） (2019)
  • 著者名/発表者名: 兵頭寿典、Md Lutfur Rahman、豊田敦、Sivasundaram Karnan、太田明伸、都築忍、 細川好孝、小西裕之
  • 学会等名: 第42回日本分子生物学会年会
• [学会発表] Introduction of Chromosomal Translocation t(11; 14) and a p53 Deletion into Normal B Cell-derived iPSCs to Elucidate the Cellular Origin of Myeloma Cells. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yanagi A, Tsuyama N, Sugai M, Abe Y, Azami Y, Yanai Y, Ota A, Sivasundaram K, Muramatsu M, Shigemura T, Sasatani M, Hashimot Y, Kamiya K, Hanamura I, Ikezoe T, Onodera M, Sakai A.
  • 学会等名: 61th ASH Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Identification of Genome-wide Molecular Characteristics in Ameloblastoma:Role of Tlr2 in Ameloblastoma Cells (2019)
  • 著者名/発表者名: S.Kondo, A.Ota, T.Ono, S.Karnan, M.Wahiduzzaman, T.Hyodo, M.L.Rahman, K.Ito, A.Furuhashi, T.Hayashi, H.Konishi, S.Tuzuki, Y.Hosokawa, Y.Kazaoka
  • 学会等名: ASCB/EMBO 2019 Meeting
  • 国際学会