| 研究課題/領域番号 |
18K08346
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| 研究機関 | 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所) |
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研究代表者 |
小井詰 史朗 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所), その他部局等, その他 (60416063)
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| 研究分担者 |
宮城 洋平 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所), 臨床研究所, 所長 (00254194)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 癌 / 血栓塞栓症 |
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| 研究実績の概要 |
血栓塞栓症（TE）は癌患者の予後不良性と関連する重要な合併症である。癌細胞は異所性に血液凝固第７因子（FVII）を産生可能であるが、そのTEへの重要性は不明である。異所発現性FVIIの癌TE発症への効果を検証するために現在FVII遺伝子の発現を恒常的に抑制した細胞の作製法を検討中である。これまで当研究室において異所性FVII遺伝子発現の抑制のためRNA干渉法を試みたが、十分に発現レベルの低下した細胞の取得に至らなかった。当研究室では同様の方法で他の複数の遺伝子の発現を抑制した細胞の取得には成功している。ゆえに異所FVII遺伝子はその抑制細胞の取得が困難な遺伝子と考えられる。本年度は卵巣がん細胞において異所性に発現しているFVIIの遺伝子の発現を他の手法、すなわちゲノム編集法を用いて遺伝子構造レベルで抑制した細胞の作製に取り組んだ。市販のキットを用いてゲノム編集（CRISPR/Cas9）処理を行い、卵巣がん細胞のFVII遺伝子構造の破壊を試みた。次にこの細胞プールについて数十クローンを単離し、増殖させた。これらの細胞についてウェスタン法によりFVIIの発現抑制を検討した。陰性コントロールゲノム編集細胞と比較したところ、ゲノム編集によりFVII発現は低下しているが完全に発現が抑制された細胞は得られなかった。得られた細胞よりDNAを抽出し塩基配列を解析したところ遺伝子構造改変反応が不十分であることが分かった。現在遺伝子構造改変原理の異なる他のゲノム編集キットを用いて細胞の取得を試みている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の計画通り研究を遂行したが、予想より実験の難度が高かったと考えられる。計画外の実験方法を試みるなど努力したが年度目標に到達しなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに得られた部分的にゲノム編集反応が起こった細胞を用いて完全にFVII遺伝子発現をノックアウトした細胞の樹立を目指す。また、例えばFVIIが細胞の増殖に極めて重要で完全ノックアウト細胞の樹立が困難と判断された場合は発現誘導タイプのゲノム編集反応を起こす細胞の樹立を検討している。また場合によっては次年度に遂行予定のゲノム編集細胞の取得に依存しない研究計画を前倒しして遂行することも検討している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
初年度に計画した実験の難度が予想より高く、初年度の研究計画を予定通り完了できなかったために次年度使用額が生じた。次年度使用額を利用し本年度も引き続き初年度の目標達制に努める。
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