| 研究課題/領域番号 |
18K08365
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| 研究機関 | 福島県立医科大学 |
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研究代表者 |
池田 和彦 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (90381392)
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| 研究分担者 |
大河原 浩 福島県立医科大学, 医学部, 講師 (10381360)
橋本 優子 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (60305357)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 骨髄増殖性腫瘍 / カルレチクリン |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、真性多血症、本態性血小板血症、骨髄線維症を含む、骨髄増殖性腫瘍におけるドライバー変異と、他の遺伝子変異が協調的に作用して病態が進展していく病態を明らかにするものである。
カルレチクリン(CALR)のexon 9におけるフレームシフト変異は、骨髄増殖性腫瘍におけるドライバー変異として、JAK2変異に次いで高頻度に認められる。我々は、ゲノム編集法を用いてマウスCalr exon 9に、骨髄増殖性腫瘍症例と同様のフレームシフトを導入した2種類(2 base insertion, CR2iおよび10 base deletion, CR10d)のノックインマウスの作出に成功した。本年度は、これら2種類のノックインマウスについて造血を詳細に解析したところ、CR2iマウスについては脾腫、髄外造血を、CR10dマウスでは白血球数および血小板数の増加や髄外造血を認めた。このことから、2種類のCalr変異ノックインマウスのそれぞれが、骨髄増殖性腫瘍の造血を反映しているものと考えられる。従来のCALR変異マウスは全てヒトのCALRを変異させたものを、人為的に導入したモデルのみであり、マウスのCalrそのものを変異させた初めてのモデルにおいても骨髄増殖性腫瘍様の造血を示すことを証明できたことは、きわめて意義深い。
今後は、JAK2変異マウスとCalr変異マウスの造血の違い、Ezh2欠失やHmga2発現がCalr変異造血に及ぼす影響を明らかにすることで、骨髄増殖性腫瘍が慢性期の増殖性造血が主体の病態からやがて骨髄線維症を起こし、さらに急性白血病へと進展していく機序の一端を明らかにすることができると期待している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
我々は、CRISPR/Cas9によるゲノム編集法を用いて、マウスCalrのexon 9に骨髄増殖性腫瘍症例と同様のフレームシフトを導入した、CR2iおよびCR10dノックインマウスの作出に成功した。これら2種類のノックインマウスについて造血を詳細に解析したところ、CR2iマウスにおいては脾腫、脾臓への巨核球の集族を、CR10dマウスでは白血球数および血小板数の増加や脾臓への巨核球の集族を認め、それぞれMPNの造血を反映していた。これまでの報告において、CALR変異を導入されたマウスは、ヒトのCALRを変異させたものを人為的に導入したモデルのみであったことから、今回マウスのCalrそのものを変異させた初めてのモデルにおいても、骨髄増殖性腫瘍様の造血を示すことを証明できたことが、きわめて意義深いことであると考えている。
現在、これらCalr変異ノックインマウスの造血幹細胞について解析中である。骨髄移植による競合的造血再構築法では、野生型マウスと比較して、CR2iマウスでは造血幹細胞の造血再構築能が著明に低下しており、CR10dマウスにおいても、造血再構築能は野生型よりも同等からやや劣っている程度であった。
このように骨髄増殖性腫瘍様の表現型を示し、かつ造血再構築能が変化している背景を明らかにするために、造血幹細胞の遺伝子発現を網羅的に調べているところである。さらに、JAK2変異マウスとCalr変異マウスの造血の違い、Ezh2欠失やHmga2発現がCalr変異造血に及ぼす影響を明らかにする。
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| 今後の研究の推進方策 |
我々は今後、Ezh2欠失やHmga2発現が、Calr変異下の造血に及ぼす影響を明らかにしたいと考えている。また、骨髄増殖性腫瘍の症例においてはJAK2変異例とCALR変異例で予後が異なっていることから、JAK2変異とCalr変異が造血に及ぼす影響の相異についても解析したいと考えている。
このため、Calr変異ノックインマウスと、Hmga2トランスジェニックマウス (Ikeda et al, Blood, 2011) やEzh2コンディショナルノックアウトマウスを交配してCalr変異ノックインHmga2トランスジェニックマウスや、Calr変異ノックインEzh2コンディショナルノックアウトマウスを作成し、造血を解析する予定である。また、JAK2V617FトランスジェニックマウスとCalr変異ノックインマウスについては、それらの造血細胞について差異を明らかにするべく、解析を進めていく。解析においては、遺伝子や蛋白の発現様式、JAK阻害剤に対する感受性を初めとする、様々な検討を予定している。
以上により、骨髄増殖性腫瘍が骨髄線維症を起こし、さらに急性白血病へと進展していく機序の一端を明らかにすることができると期待している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
Calr変異ノックインマウスにおいて、ヒトの骨髄増殖性腫瘍を反映した表現型を再現し得た。また、Calr変異ノックインマウスの造血幹細胞の造血再構築能がむしろ低下していることが判明した。これらの結果から、現在、Calr変異ノックインマウスより造血幹細胞をflow sortingにより得て、RNA sequence実験を施行しているところである。現在、微量RNA抽出まで成功していることを、バイオアナライザーにより確認したところである。この実験は年度をまたいでおり、会計年度を次年度としたため、次年度使用額が生じている。
今後、これらflow sortingおよびRNA sequenceの実験を、他のマウスにおいても行う。また、real time PCRやWestern Blotなどによる確認の実験も進める予定である。
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