| 研究課題/領域番号 |
18K08368
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
奥田 恵子 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70305572)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | ABLファミリー遺伝子 / 造血器腫瘍 / 白血病 / Mastcytosis / 発がんシグナル / 発がん制御 |
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| 研究実績の概要 |
ABLファミリー遺伝子であるABL(ABL1)とARG(ABL2)は互いの構造に約80%の相同性を有しているが、ABLが白血病原因として広く認知されているに対してARGの機能はまだよく理解されていない。非受容体型チロシンキナーゼである両者の機能解析には安定した活性化誘導が必須であるが、共に白血病患者より検出された転座融合遺伝子であるTEL/ABL, TEL/ARGでは、TEL側の切断点も同一部位で互いの遺伝子構造ならびに蛋白アミノ酸配列に非常に高い相同性を有し、恒常的にキナーゼ活性が亢進している。私はTEL/ABLとTEL/ARG を互いの活性型相補対照モデルと捉えて比較・検討する事により両者の機能と白血病における役割の解析に従事してきた。これまでに確認した両者の生物作用における注目すべき２つの相違点は
1. 増殖因子依存性細胞株においてTEL/ABLは強い自己増殖作用を誘導するが、TEL/ARG の細胞への増殖作用は軽微である。
2, 生体モデルにおいてTEL/ABLマウスは急性骨髄性白血病を発症して早期死亡するが、TEL/ARGマウスでは長期経過後に特異的なMastcytosisを発症する。
細胞増殖作用については両者C末端構造を相互置換するとABL-C末存在で亢進、ARG-C末存在で減弱を認め、C末端がその責任領域であると確認した。
以上の基礎結果に基づき、特異的作用を導く分子機構について新たにYeast Two Hybrid手法を用いた検討を開始している。細胞生物作用から注目したC末端領域に特異的な結合分子はまだ検出できていないが、ARGにのみSH2-kinase domain領域間にSTAT3の結合が認められ、ファミリー遺伝子間での機能特性におけるアイソフォームの使い分けが注目された。さらに検索を続けて白血病化の抑制や病態方向性の決定に関わる機構の解明を目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
初年度から実験材料となる変異体遺伝子の構築やGST融合蛋白の精製などの準備、また新たに導入したYeast Two Hybrid (YTH)手法に対して導入するプラスミドの作製、手技の習得から条件設定の基礎実験を経て、これまでのYTHスクリーニンでARGに特異的な結合分子としてSTAT3を検出することができ、vitroでの検討は概ね順調に進展している。
今年度やや遅れている主原因は細胞を保存していた超低温槽の不慮の故障により実験用細胞株が全滅した為、予定していた細胞を用いた遺伝子産物発現による蛋白相互作用や生物作用の確認ができなかったことである。特により厳密な遺伝子作用の観察に必要な遺伝子誘導発現株の損失により、目的遺伝子を導入した発現株の樹立以前に、発現誘導規制遺伝子を有する親株から作製し直す必要が生じた。早期の細胞生物学的解析の再開を目指し、遺伝子誘導発現株の樹立に続いては直ちにTEL/ARG, TEL/ABLの野生型ならびに各種変異体遺伝子の導入による誘導発現細胞株の樹立を急いでいる。
細胞を用いたvivoの実験は停滞しているが、ARGとSTAT3の結合はARGキナーゼ不活化変異体には認められなかった事より、その結合様式は自己リン酸化したARGチロシン残基へのSTAT3のSH2を介した結合であると考え、YTH反応で用いたSH2-Kinase domain構造内に存在する16個のチロシン残基のそれぞれをフェニルアラニンに置換した点変異遺伝子を作製中である。完成した全ての点変異遺伝子を用いて改めてYTHにて結合能を観察することにより、ARGへのSTAT3結合部位の同定を試みる。細胞生物作用の解析は中断状態であるが、その間には分子生物手法を用いたvitroの実験系に集中する事で遅れを補うように努めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
Vitro実験としては引き続きYeast Two Hybrid system(YTH)を用いてARGまたはABLとの特異的結合蛋白の検索スクリーニング(特に両者C末端領域での違いを重点的に)を続けてゆきながら、同時に既に単離したARG特異的結合分子と示唆されるSTAT3に対して両者の結合様式を解析する。これまでの検討からSTAT3の結合はARGのSH2-kinase domain領域部分に認められたが、反してARGキナーゼ不活化変異(K317R)を持つ同領域部分では認められなかった。よって様式としてARG自己リン酸化チロシン残基へのSTAT3のSH2を介した結合を疑っている。この確認に向けて同領域内に存在する16個のチロシン残基を順次フェニルアラニンに置換し、最終的にYTHで結合しない部位を同定する。
Vivoの実験に向けては、まず必須材料である良好な誘導規制遺伝子発現株の樹立、その後直ちにTEL/ABL, TEL/ARGを導入して両者の誘導発現株の樹立を急ぐ。細胞株が樹立でき次第、YTHで得られたvitroの結果についてvivoでの再現性を確認する。つまりARGとSTAT3のvivoでの結合や相互作用、STAT3自体のリン酸化状態などを発現細胞内因性蛋白での免疫沈降/ウェスタンブロッティング、Far-Western, pull down assay 等で確認し、続いて上記で判明した結合部位を潰した変異体遺伝子を導入して細胞内での結合の確認や生物学的作用の変化を観察する。STAT3はその結合部位から造腫瘍活性よりはむしろ特異的なmastocytosis誘導に見られる病態の方向性に関与している可能性も疑っており、長期的にはマウスモデルの作製により生体での白血病化における影響や変化を検討する。
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