| 研究課題/領域番号 |
18K08439
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| 研究機関 | 大分大学 |
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研究代表者 |
平松 和史 大分大学, 医学部, 教授 (80301381)
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| 研究分担者 |
門田 淳一 大分大学, 医学部, 教授 (50233838)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | Candida albicans / siRNA / (1,3)β-D-グルカン |
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| 研究実績の概要 |
本研究に用いる菌株として、ATCC 2091、60193、26790株の3菌種を準備した。Tushl Tらの方法を用いてCandida albicansの(1,3)β-Ｄ-グルカン合成に関与するCaFKS1遺伝子に対するsiRNAの設計を行い、外部業者に委託してその合成を行った。合計4種類(siRNA1～4)のsiRNAを作成した。そのうち2種類のsiRNA(siRNA1、2)については、真菌内への取り込みを高効率にするためにsiRNAにコレステロール修飾を行ったものも合成した。C.albicans ATCC 60193株を100CFU/mlとなるように調製した菌液に、各種siRNAを5μMの濃度となるように添加し、6、12、18、24、48時間後に各培地中の菌量を測定した。siRNAを含まない通常の培地で増菌させると、6時間後に1000～3000CFU/ml、12、24時間後にはそれぞれ1000000～1500000CFU/ml、20000000～30000000CFU/mlへと増菌していた。合成したsiRNA1あるいは2を含む培地での増菌は、siRNAを含まない培地での増菌と同様であった。一方、コレステロール修飾siRNA1ではsiRNAを含まない場合と同様の増菌曲線となっていた。コレステロール修飾siRNA2を含む培地では、6、12、18時間後のC.albicansの菌数は、siRNAを含まない培地の菌数と同様であったが、24時間後の菌数はsiRNAを含まない培地に比べておよそ半数の菌量であった。しかしながら、48時間後にはほぼ同等の菌量となっていた。こうした結果はsiRNA1や2はC.albicansの増殖を抑制する十分な効果を有しないが、コレステロール修飾siRNA2にはその増菌を抑制する可能性があることを示していると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画通り、siRNAの設計及び合成を行った。in vitroにおける検討は、順調に行うことができ、その結果を得ることができた。コレステロール修飾siRNAで、増菌抑制効果を一部認めたものの、当初想定していたほどのsiRNAのC.albicansに対する増菌抑制効果は十分なものは認められなかった。そのため、「当初の計画以上に進展している」という評価とはならず、「おおむね順調に進展している」と評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、合成した他の2種類のsiRNA(siRNA3、4)の効果について検討を行っている。また、C.albicansへのsiRNAの取り込みの状況を検討するために蛍光色素を付加したsiRNAを合成し、共焦点レーザー顕微鏡を用いてsiRNAの取り込みの効率について検討を行うための準備を進めている。またコレステロール修飾siRNA2は24時間後に一部その増菌を抑制する効果を認めたことから、コレステロール修飾siRNA2を経時的に添加し、その効果を検討することを計画している。またコレステロール以外の修飾物質の合成の可能性についても検討していく予定である。in vitroでの増菌抑制効果が得られたsiRNAを用いてカンジダ血症マウスモデルにおける致死抑制効果についても検討を進めていきたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
培地やプラスチックピペット、シャーレなどの消耗品を購入予定であったが、現有の物品で実験を遂行することができたため、その額が大きく抑制されたことから次年度使用額が生じた。またC.albicansの増菌抑制効果が認められたsiRNAについて、mRNAの発現量を測定する予定であったが、十分な効果を示すsiRNAを見い出すことができなかった。そのため、mRNA抽出試薬やreal timePCR用試薬の購入を行わなかったことも次年度使用額が生じた理由である。次年度には、これら培地などの消耗品を購入予定であり、十分な増菌抑制効果を認めるsiRNAを見い出し、mRNAの発現量測定の検討を行うこととしており、繰越額を含めて使用する予定である。
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