| 研究課題/領域番号 |
18K08439
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| 研究機関 | 大分大学 |
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研究代表者 |
平松 和史 大分大学, 医学部, 教授 (80301381)
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| 研究分担者 |
門田 淳一 大分大学, 医学部, 特任教授 (50233838)
小宮 幸作 大分大学, 医学部, 准教授 (50727550)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | Candida albicans / siRNA / (1,3) β-D-グルカン |
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| 研究実績の概要 |
昨年度に引き続き、合成したsiRNAのin vitroでの菌の増殖抑制効果の検討を行った。菌株としてCandida albicans ATCC 60193株を用いた。これまでに合成を行い、増殖抑制実験が行えていなかったC.albicansの（1, 3）β－D－グルカン合成に関連するCaFKS1遺伝子に対する2種類のsiRNAを用いて検討を行った。これまでの実験と同様に菌株を100CFU/mlとなるように調整した菌液にsiRNAを添加し培養後、経時的に菌量の測定を行った。siRNAを含まないコントロールの培地中では培養開始6時間後にはおよそ500CFU/ml、12時間後には約200000CFU/ml、24時間後には5000000CFU/ml、48時間後には30000000CFU/mlと経時的に増加していた。一方で、コレステロール非修飾のsiRNA 5 および6を5μM添加した培地では、6時間後、12時間後、24時間後、48時間後いずれの時間においてもコントロール群と同等に菌の増加を認めていた。さらに、コレステロール修飾したsiRNA 5および6を用いて増殖抑制効果の検討も行ったが、コントロール群と同様に増菌が認められ、コレステロール修飾によるsiRNAにおいても増殖抑制効果は認められなかった。こうした結果を受け、当初準備した別のC. albicans ATCC2091株を用いて、検討を行った。60193株と同様に100CFU/mlとなるように調整した2091株の菌液にsiRNAを添加する群と添加しない群を作成し増殖抑制効果を検証したが、siRNA 5および6においては、両群間に差を認めなかった。またコレステロール修飾siRNA 5および6でも有意な増殖抑制効果は認めなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初計画したように非修飾のsiRNAやコレステロール修飾siRNAの合成は行うことはできている。in vitroの実験はある程度予定通りに実施することができているが、予想した増菌抑制効果を示すsiRNAが検出できていない状況である。またコレステロール修飾のsiRNAでもin vitroにおける増菌抑制効果を得ることができず、有効なsiRNAの配列を見い出せていない。そのため令和2年度に実施予定であったin vivoでの実験を行えていないため「やや遅れている」と評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
合成したコレステロール修飾および非修飾のsiRNAをこれまでの実験で用いたC.albicans株とは異なる菌株に対する増殖抑制効果について検討を進めている。またC.albicansへのsiRNAの取り込みの状況を検討するために蛍光色素で標識したsiRNAを合成し、共焦点レーザー顕微鏡を用いてsiRNAのC.albicans内への取り込みの状況を評価する実験の準備を進めている。さらに添加するsiRNAの濃度をより高濃度とすることや経時的にsiRNAを追加投与することによって効果が得られるかどうか検討を行っていく予定にしている。in vitroで効果が得られるsiRNA配列が明らかになれば、そのsiRNAを用いてカンジダ血症マウスモデルでの致死抑制効果について検討を進めていくこととしている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
プラスチックピペットやシャーレ、チューブ、培地などの消耗品の購入を予定していたが、昨年度までに購入していた物品で、実験を実施することができた。またin vivoでの実験を予定し、マウスを購入することとしていたが、効率よくC.albicansの増殖を抑制するsiRNAが検出されていないため、マウスの購入を行っていない。こうした理由から次年度使用額が生じた。次年度にはsiRNAの合成や消耗品の購入を予定しており、繰越額を使用することとしている。
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