| 研究課題/領域番号 |
18K08443
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
井坂 雅徳 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 助教 (40336673)
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| 研究分担者 |
長谷川 忠男 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (10314014)
前山 順一 国立感染症研究所, 血液・安全性研究部, 主任研究官 (40199641)
立野 一郎 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (50311642)
青山 峰芳 名古屋市立大学, 大学院薬学研究科, 教授 (70363918)
矢木 宏和 名古屋市立大学, 大学院薬学研究科, 講師 (70565423)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | A群連鎖球菌 / 二成分制御因子 / バイオフィルム / センサータンパク質 / ヒスチジンキナーゼ |
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| 研究実績の概要 |
A群連鎖球菌は、咽頭炎や猩紅熱を引き起こす原因菌である。1987年にアメリカでこの細菌の劇症型症例報告が始まってから、日本国内でも同様の報告が増加している。劇症型への機序について様々な研究報告が出ているが、一向に完全解明に至っていない。A群連鎖球菌劇症型株は健常人でも検出され、劇症型株に感染することが発症に必須ではない疑問がある。そこで、劇症型が発症するにはA群連鎖球菌がヒトへ感染後、変化するための何らかの情報を受け取らなければならないと考えた。ここで外界情報を受け取る二成分制御因子の研究が進んでいるStreptococcus mutansに着目した。A群連鎖球菌と同属のこの細菌は、乳酸、酪酸を産生し、歯にバイオフィルムを形成して虫歯を増悪させる。この細菌の二成分制御因子は酸感受とバイオフィルム形成に関与する。同様の仕組みがA群連鎖球菌に存在するかを調べると、A群連鎖球菌の二成分制御因子の一つであるspy1588遺伝子欠損株は、バイオフィルム産生低下、酸抵抗性の低下を示した。我々は、酸を感受する二成分制御因子と、それに関連する遺伝子群に変異が劇症型に生じていると考え、研究を現在進めている。
本年度の研究は、spy1588遺伝子産物のSPY1588タンパク質の機能を探るべく、このタンパク質の遺伝子組み換え体作製を実施した。この遺伝子組み換え体をpETベクターに組み込み、大腸菌で発現させ、膜タンパク質として精製することができた。また、このタンパク質はヒスチジンキナーゼであるため、その活性測定を実施すると、キナーゼドメインに関与するアミノ酸部位のアミノ酸置換体で抑制することができた。また、酸性環境下でこの組換え体が自己リン酸化することも突き止めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
SPY1588組換え体の酸性状況下での自己リン酸化を測定し、その結果を得た。また、データベースでも検索できていなかったリン酸化ドメインを解析できた。膜タンパク質を大腸菌の外膜上で発現させ、精製するには大量の培養が必要であることが分かったため、発現方法の見直しにより量的にタンパク質を得るように改良を重ねたい。
組換え体の精製は、発現量が少ないために困難を極めた。そのために大腸菌の大量培養を行い、ようやく精製にこぎつけた。SPY1588の精製は、一回の界面活性剤で作用させると他の膜タンパク質とアグリゲートしてしまい精製が困難であった。そこで、他の界面活性剤で処理し、前処理をする必要があり、この点で精製度が向上した。のちにリポソーム化を施し、自己リン酸化が測定できた。今後は、リン酸化の測定方法に改良を加えて、今後の自己リン酸化測定の改良に役立てたい。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は、SPY1588の立体構造を測定すべく、部分的ペプチドを発現させ、X線構造解析の資料作製を計画しています。SPY1588そのものの発現でも苦慮するところがあるため、ペプチド合成にはさらなる抑制がかかると考えられます。pETベクターによる部分的SPY1588発現は、タンパク質の不溶化が発生する。これを解決するためにコンピーテントセルにあたる大腸菌の選別が必要となる。また、連鎖球菌で発現している同じ立体構造を保持するように、立体構造を修復するベクターを導入したコンピーテントセルに組換え体を発現させ、元の構造に近づけたタンパク質を得る工夫を実施する。また、pColdベクターの購入を検討し、低温での発現実施のため実験計画を立てて実施に向かう。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
現在、SPY１５８８欠損株の酸感受性とバイオフィルム産生にいたる論文を作成中です。すでにドラフトは完成していて、英文添削に出す予定にしております。この英文添削の出費のために残が発生しております。英文が完成次第、添削費用にこの残を使用する予定です。
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