| 研究課題/領域番号 |
18K08443
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
井坂 雅徳 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (40336673)
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| 研究分担者 |
長谷川 忠男 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (10314014)
前山 順一 国立感染症研究所, 血液・安全性研究部, 主任研究官 (40199641)
立野 一郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 講師 (50311642)
青山 峰芳 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 教授 (70363918)
矢木 宏和 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 講師 (70565423)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | A群連鎖球菌 / 二成分制御因子 / バイオフィルム / センサータンパク質 / ヒスチジンキナーゼ / 組換えタンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
A群連鎖球菌は、咽頭炎や猩紅熱を引き起こす原因菌である。劇症型への機序について様々な研究報告が出ているが、一向に完全解明に至っていない。A群連鎖球菌劇症型株は健常人でも検出され、劇症型株に感染することが発症に必須ではない疑問がある。そこで、劇症型が発症するにはA群連鎖球菌がヒトへ感染後、変化するための何らかの情報を受け取らなければならないと考えた。ここで外界情報を受け取る二成分制御因子の研究が進んでいる、Streptococcus mutansに着目した。A群連鎖球菌と同属のこの細菌は、乳酸、酪酸を産生し、歯にバイオフィルムを形成して虫歯を増悪させる。この細菌の二成分制御因子は酸感受とバイオフィルム形成に関与する。同様の仕組みがA群連鎖球菌に存在するかを調べると、A群連鎖球菌の二成分制御因子の一つであるspy1588遺伝子欠損株は、バイオフィルム産生低下、酸抵抗性の低下を示した。我々は、酸を感受する二成分制御因子と、それに関連する遺伝子群に変異が劇症型に生じていると考え、研究を現在進めている。
本年度はSPY1588の立体構造を測定すべく、部分的ペプチドをpETベクターとタンパク質発現用大腸菌で発現させ、X線構造解析の資料作製を実施した。
SPY1588そのものの発現でも苦慮するところがあり、ペプチド合成にはさらなる抑制がみられた。pETベクターによる部分的SPY1588発現は、タンパク質の不溶化が発生した。これを解決するためにコンピーテントセルにあたる大腸菌の選別、ベクター候補の選出など様々な組み合わせでタンパク質を発現させた。pColdベクターによる低温発現実施では、発現をしたものの分解も生じてしまい、産物が回収できなかった。そこで封入体から産物を回収し、リフォールディングすることで部分ペプチドの可溶性を得ることが出来た。この後、結晶化を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
SPY1588の部分的ペプチドを大腸菌に産生させるために、pETベクター（１５b、２２b、３２a）ベクター、pGEXベクターおよびpColdベクターを用いて、部分ペプチド配列の遺伝子配列を各ベクターへ導入した。大腸菌BL２１（DE3）、Rosetta Gami 2(DE3), Lemo21(DE3)に、各構築ベクターを導入した。ペクターを導入した大腸菌をIPTGを添加して、融合タンパク質合成を誘導させ、超音波処理、界面活性剤処理などを施し、SDS-PAGEとCBB染色により部分ペプチドの誘導を確認した。Niレジンによるアフィニティーカラム精製を施したが、樹脂に結合しなかった。Niに結合するためにヒスチジンタグが露出していないと考えた。各ベクターでペプチドを発現すると、概ね封入体を形成するため、精製方法をグアニジンによる変性とベータゼオライトによる吸着およびポリエチレングリコール、アルギニンによるリフォールヂングに変更した。このことにより、量的に可溶化した部分ペプチドが回収できるようになった。今後は、このペプチドをさらに精製して結晶化を実施する。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は、SPY1588の立体構造をX線構造解析により明らかとし、酸感受性部位とリン酸化との機能を明らかにする。この方法は、共同研究の矢木などの協力により遂行し、一部名古屋大学の方々にも協力を依頼して立体構造とSYP1588の機能解析を推進する。
A群レンサ球菌が酸を感受してバイオフィルム等の産生を促進する裏付けとして、劇症型発症患者の血液データを解析し、患者血液のpHの変動の統計を算出する。血液データを使用することで、まずレンサ球菌感染症による組織部位および血液中の変動が劇症型と関連するか否かを明らかにする。
また、A群レンサ球菌が劇症型に至るまでの経緯の中で、ヒトの細胞での炎症を引き起こす因子も合わせて検索する。免疫細胞を惹起および誘導、遊走を引き起こす因子は数多く報告されている。しかし、有機酸や脂肪酸などのオータコイドに関与した分子が劇症型に関与し、この二成分制御因子に関連しているものと推測される。これらの分子を検索し、劇症型発症機序の忌明につなげる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
現在進行中のSPY1588タンパク質の立体構造とその機能についての論文作成および論文構成費用のために残を出しております。今年度には論文を出す予定ですので、その残高を使用する予定です。
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