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2019 年度 実施状況報告書

A群連鎖球菌spy1588遺伝子の酸感受性機構と病原性発症機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号 18K08443
研究機関名古屋市立大学

研究代表者

井坂 雅徳  名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (40336673)

研究分担者 長谷川 忠男  名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (10314014)
前山 順一  国立感染症研究所, 血液・安全性研究部, 主任研究官 (40199641)
立野 一郎  名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 講師 (50311642)
青山 峰芳  名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 教授 (70363918)
矢木 宏和  名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 講師 (70565423)
研究期間 (年度) 2018-04-01 – 2022-03-31
キーワードA群連鎖球菌 / 二成分制御因子 / バイオフィルム / センサータンパク質 / ヒスチジンキナーゼ / 組換えタンパク質
研究実績の概要

A群連鎖球菌は、咽頭炎や猩紅熱を引き起こす原因菌である。劇症型への機序について様々な研究報告が出ているが、一向に完全解明に至っていない。A群連鎖球菌劇症型株は健常人でも検出され、劇症型株に感染することが発症に必須ではない疑問がある。そこで、劇症型が発症するにはA群連鎖球菌がヒトへ感染後、変化するための何らかの情報を受け取らなければならないと考えた。ここで外界情報を受け取る二成分制御因子の研究が進んでいる、Streptococcus mutansに着目した。A群連鎖球菌と同属のこの細菌は、乳酸、酪酸を産生し、歯にバイオフィルムを形成して虫歯を増悪させる。この細菌の二成分制御因子は酸感受とバイオフィルム形成に関与する。同様の仕組みがA群連鎖球菌に存在するかを調べると、A群連鎖球菌の二成分制御因子の一つであるspy1588遺伝子欠損株は、バイオフィルム産生低下、酸抵抗性の低下を示した。我々は、酸を感受する二成分制御因子と、それに関連する遺伝子群に変異が劇症型に生じていると考え、研究を現在進めている。
本年度はSPY1588の立体構造を測定すべく、部分的ペプチドをpETベクターとタンパク質発現用大腸菌で発現させ、X線構造解析の資料作製を実施した。
SPY1588そのものの発現でも苦慮するところがあり、ペプチド合成にはさらなる抑制がみられた。pETベクターによる部分的SPY1588発現は、タンパク質の不溶化が発生した。これを解決するためにコンピーテントセルにあたる大腸菌の選別、ベクター候補の選出など様々な組み合わせでタンパク質を発現させた。pColdベクターによる低温発現実施では、発現をしたものの分解も生じてしまい、産物が回収できなかった。そこで封入体から産物を回収し、リフォールディングすることで部分ペプチドの可溶性を得ることが出来た。この後、結晶化を行う予定である。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

SPY1588の部分的ペプチドを大腸菌に産生させるために、pETベクター(15b、22b、32a)ベクター、pGEXベクターおよびpColdベクターを用いて、部分ペプチド配列の遺伝子配列を各ベクターへ導入した。大腸菌BL21(DE3)、Rosetta Gami 2(DE3), Lemo21(DE3)に、各構築ベクターを導入した。ペクターを導入した大腸菌をIPTGを添加して、融合タンパク質合成を誘導させ、超音波処理、界面活性剤処理などを施し、SDS-PAGEとCBB染色により部分ペプチドの誘導を確認した。Niレジンによるアフィニティーカラム精製を施したが、樹脂に結合しなかった。Niに結合するためにヒスチジンタグが露出していないと考えた。各ベクターでペプチドを発現すると、概ね封入体を形成するため、精製方法をグアニジンによる変性とベータゼオライトによる吸着およびポリエチレングリコール、アルギニンによるリフォールヂングに変更した。このことにより、量的に可溶化した部分ペプチドが回収できるようになった。今後は、このペプチドをさらに精製して結晶化を実施する。

今後の研究の推進方策

次年度は、SPY1588の立体構造をX線構造解析により明らかとし、酸感受性部位とリン酸化との機能を明らかにする。この方法は、共同研究の矢木などの協力により遂行し、一部名古屋大学の方々にも協力を依頼して立体構造とSYP1588の機能解析を推進する。
A群レンサ球菌が酸を感受してバイオフィルム等の産生を促進する裏付けとして、劇症型発症患者の血液データを解析し、患者血液のpHの変動の統計を算出する。血液データを使用することで、まずレンサ球菌感染症による組織部位および血液中の変動が劇症型と関連するか否かを明らかにする。
また、A群レンサ球菌が劇症型に至るまでの経緯の中で、ヒトの細胞での炎症を引き起こす因子も合わせて検索する。免疫細胞を惹起および誘導、遊走を引き起こす因子は数多く報告されている。しかし、有機酸や脂肪酸などのオータコイドに関与した分子が劇症型に関与し、この二成分制御因子に関連しているものと推測される。これらの分子を検索し、劇症型発症機序の忌明につなげる。

次年度使用額が生じた理由

現在進行中のSPY1588タンパク質の立体構造とその機能についての論文作成および論文構成費用のために残を出しております。今年度には論文を出す予定ですので、その残高を使用する予定です。

  • 研究成果

    (8件)

すべて 2020 2019

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 3件) 学会発表 (5件)

  • [雑誌論文] Prevalence of emm1 Streptococcus pyogenes having a novel type of genomic composition.2019

    • 著者名/発表者名
      Tatsuno I, Isaka M, Matsumoto M, Hasegawa T.
    • 雑誌名

      Microbiol Immunol

      巻: 63 ページ: 413-426

    • DOI

      10.1111/1348-0421.12739.

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Complete Genome Sequence of emm1 Streptococcus pyogenes 10-85, a Strain Isolated from a Patient with Streptococcal Toxic Shock Syndrome in Japan.2019

    • 著者名/発表者名
      Tatsuno I, Isaka M, Matsumoto M, Nishio N, Matsui H, Hasegawa T.
    • 雑誌名

      Microbiol Resour Announc

      巻: 13 ページ: e00453-19

    • DOI

      10.1128/MRA.00453-19.

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Homologous role of CovRS two-component regulatory system in NAD(+) -glycohydrolase activity in Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis as in Streptococcus pyogenes.2019

    • 著者名/発表者名
      Hasegawa T, Matsumoto M, Hata N, Yano H, Isaka M, Tatsuno I.
    • 雑誌名

      APMIS

      巻: 127 ページ: 87-92

    • DOI

      10.1111/apm.12914.

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] Prevalence of emm1 Streptococcus pyogenes having a novel type of genomic composition2020

    • 著者名/発表者名
      立野 一郎,井坂 雅徳,松本 昌門,長谷川 忠男
    • 学会等名
      第93回 日本細菌学会総会
  • [学会発表] 新規結核菌抗原と DNA アジュバントからなる成人肺結核に対する ブースターワクチンの開発2020

    • 著者名/発表者名
      前山 順一,林 大介,山本 十糸子,大石 紳二,山崎 利雄,尾関 百 合子,鈴木史子,伊保澄子,松本壮吉,山本三郎
    • 学会等名
      第93回 日本細菌学会総会
  • [学会発表] A 群連鎖球菌二成分制御因子 SPY1588 の酸感受性と自己リン酸 化について2019

    • 著者名/発表者名
      井坂 雅徳,立野 一郎,前山 順一,長谷川 忠男
    • 学会等名
      第92回 日本細菌学会総会
  • [学会発表] 新規 A 型 CpG-DNA G9.1 のアジュバント作用におけるインター フェロンアルファの関与2019

    • 著者名/発表者名
      前山 順一,伊保 澄子,山本 三郎
    • 学会等名
      第92回 日本細菌学会総会
  • [学会発表] Prevalence of emm1 Streptococcus pyogenes having a novel type of genomic composition2019

    • 著者名/発表者名
      立野一郎,井坂雅徳, 松本昌門, 長谷川忠男
    • 学会等名
      第56回 日本細菌学会中部支部総会

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公開日: 2021-01-27  

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