| 研究課題/領域番号 |
18K08443
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
井坂 雅徳 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (40336673)
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| 研究分担者 |
長谷川 忠男 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (10314014)
前山 順一 国立感染症研究所, 血液・安全性研究部, 主任研究官 (40199641)
立野 一郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 講師 (50311642)
青山 峰芳 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 教授 (70363918)
矢木 宏和 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 講師 (70565423)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | A群連鎖球菌 / 二成分制御因子 / バイオフィルム / ヒスチジンキナーゼ |
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| 研究実績の概要 |
A群連鎖球菌は、咽頭炎や猩紅熱を引き起こす原因菌である。劇症型への機序について様々な研究報告が出ているが、一向に完全解明に至っていない。A群連鎖球菌劇症型株は健常人でも検出され、劇症型株に感染することが発症に必須ではない疑問がある。そこで、劇症型が発症するにはA群連鎖球菌がヒトへ感染後、変化するための何らかの情報を受け取らなければならないと考えた。ここで外界情報を受け取る二成分制御因子の研究が進んでいる、Streptococcus mutansに着目した。A群連鎖球菌と同属のこの細菌は、乳酸、酪酸を産生し、歯にバイオフィルムを形成して虫歯を増悪させる。この細菌の二成分制御因子は酸感受とバイオフィルム形成に関与する。同様の仕組みがA群連鎖球菌に存在するかを調べると、A群連鎖球菌の二成分制御因子の一つであるspy1588遺伝子欠損株は、バイオフィルム産生低下、酸抵抗性の低下を示した。我々は、酸を感受する二成分制御因子と、それに関連する遺伝子群に変異が劇症型に生じていると考え、研究を現在進めている。
本年度はSPY1588の立体構造を測定すべく、部分的ペプチドをpETベクターとタンパク質発現用大腸菌で発現させ、X線構造解析の資料作製を実施した。
Spy１５８８の遺伝子組換え体作成を実施した。昨年精製法を一部改良して実施したが、タンパク質が凝集して精製困難な場合が多いため、精製段階からの見直しを行いました。すると、大腸菌由来であろう凝集物が目的産物に結合して精製を阻害していることを突き止めた。この阻害物の除去の精製法が得られたので、再度純度を上げた精製法でペプチドを精製しています。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
SPY1588の部分的ペプチドを大腸菌に産生させるために、pETベクター（１５b、２２b、３２a）へ部分ペプチド配列の遺伝子配列をへ導入した。大腸菌BL２１（DE3）、Rosetta Gami 2(DE3),Lemo21(DE3)に、各構築ベクターを導入した。ペクターを導入した大腸菌をIPTGを添加して、融合タンパク質合成を誘導させ、超音波処理、界面活性剤処理などを施し、SDS-PAGEとCBB染色により部分ペプチドの誘導を確認した。
前回はNiレジンによるアフィニティーカラム精製を施し、精製方法をグアニジンによる変性とベータゼオライトによる吸着およびポリエチレングリコール、アルギニンによるリフォールヂングに変更した。ここでも凝集物が発生した。そのため、目的産物をTAPS化し、強制的に陽イオン化を施し、陽イオン交換樹脂で精製した。すると、凝集物や目的産物が変性したタンパク質も分離し、可溶化した目的産物がようやく得られた。この精製法を樹立することと、培養が大量になるために時間を要した。
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| 今後の研究の推進方策 |
タンパク質の部分精製が遅れてしまい、その結晶化まで至っていない。そのため今年度は、 Spy1588 部分ペプチドの結晶化を実施し、その構造解析までに至る。また、A群連鎖球菌感染症で劇症型を発症した患者血清のpHガスの統計を取るための準備を行っている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究分担者の２名で、研究費の使用について請求額より使用額が少なかったことがありました。
そのため、一部に次年度仕様額が0より大きく出ました。消耗品仕様で大きく購入しなかったことによるとのことでした。
今年度は、２名の分担者で、現状で仕様する消耗品が発生するため、その購入金するとのことです。
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