| 研究課題/領域番号 |
18K08446
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| 研究機関 | 埼玉医科大学 |
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研究代表者 |
樽本 憲人 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (00746993)
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| 研究分担者 |
前田 卓哉 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (20383763)
早川 智 日本大学, 医学部, 教授 (30238084)
中山 周一 国立感染症研究所, 細菌第一部, 主任研究官 (80280767)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 梅毒 |
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| 研究実績の概要 |
本研究計画の目的は、検体採取から結果の判定までがその場で実施可能であり、限られた機器で実施可能なLAMP法を用い、マクロライド耐性の有無についても同時判定可能な梅毒トレポネーマのPOCTを開発することである。
前年度までに、臨床検体の使用に関する埼玉医科大学倫理委員会の承認 (番号885) を受け、サブクローニングしたプラスミドおよびT. pallidumを除く29菌種のゲノムDNAで感度、特異度を評価した。また、耐性に関与するA2058をclampし、かつLAMPプライマーの伸長末端が相補鎖に結合することを阻害するようPNAプローブを設計した。野生株と変異株を合計3株ずつLAMP反応液に添加し、野生株(WT)の反応を阻害するように設計されたPNAプローブ加えたものと加えなかったもので反応を確認した。その結果、PNA非添加のLAMP反応では、WTおよび変異株(MT)においてLAMP反応がみられたが、PNA添加のLAMP反応では、MTのみ反応がみられ、WTは反応が見られなかった。これらの反応はいずれも再現性を確認することができた。
次に、A2058GのMT15検体およびWT3検体、計18検体に対してPNA非添加のLAMP法を実施したところ、1回目は100%(18/18検体)で増幅が見られた(表)。再現性を確認したところ、1検体を除く94.4%(17/18検体、感度、特異度)で反応が確認された。次に、MTでの反応を阻害するclamping probe (PNA) 4mM添加したLAMP法を実施したところ、WTの3検体ではすべて増幅がみられず、一方、MT15検体すべてで増幅がみられた。再現性を確認したところ、WTでは再現性が確認されたが、MT 15検体中、1検体において反応がみられなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
前年度に、野生株と変異株を1株ずつLAMP反応液に添加し、WTの反応を阻害するように設計されたPNAプローブ加えたものと加えなかったもので反応を確認できていたが、追加で2株児実施したところ、同様の結果が得られ、PNAプローブが適切にWTのLAMP反応を高い精度で阻害できていることが確認され、期待された結果であった。
また、臨床検体を用いた解析を行った。MT15検体およびWT3検体、計18検体に対してPNAの添加の有無でLAMP法を実施したところ、高い感度、特異度で期待された結果が得られた。
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| 今後の研究の推進方策 |
臨床検体をさらに増やして、感度特異度についての検討を行う。現在、WT11検体、MT55検体まで実施可能である。さらに、これらのデータを用いて学会や論文発表を行い、方法および結果について意見交換し、追加で検討すべき課題がないか、今回の結果を評価していく。また、LAMP以外の核酸増幅検査を用いて、さらに簡便なPOCT法の検討を行い、梅毒診断をより簡便にし、治療を適切にできる検査法の開発についての発案につなげる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
試薬購入時期の調整のため。また、年度初めには試薬購入を多数行う予定である。
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