| 研究課題/領域番号 |
18K08450
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| 研究機関 | 東京女子医科大学 |
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研究代表者 |
越野 一朗 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (80328377)
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| 研究分担者 |
新敷 信人 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (80569658)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | マラリア原虫 / 赤血球 / PKAリン酸化 |
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| 研究実績の概要 |
宿主赤血球内cAMP濃度の上昇はマラリア原虫の赤血球侵入をむしろ抑制するという、我々の当初の仮説とは異なる昨年度の結果を踏まえ、細胞内cAMPの上昇、赤血球膜タンパク質のPKAリン酸化、ならびに原虫の赤血球侵入との相関を実証するための基礎的な実験を行った。
PKAリン酸化を認識する抗体を用いたイムノブロット解析により、膜透過性cAMPアナログ（Sp-cAMP）は濃度依存的に1）いくつかの赤血球膜骨格蛋白質をリン酸化すること、2）そのうちデマチンが最も強くリン酸化されること、3）デマチンのリン酸化の程度と原虫の侵入率が逆相関すること、を明らかにした。この効果が赤血球膜骨格蛋白質のPKAリン酸化によるものであることを確認するために、ミリスチン酸修飾したPKI（PKI-m。膜透過性のPKA阻害剤）をSp-cAMPと共在させ、リン酸化を抑制した時に原虫の侵入が回復するかを検証中である。
他方、我々による昨年度のデータと一致しない先行研究（Harrison et al., 2003）の追試を行ったところ、彼らの報告とは異なりb2アドレナリン受容体のアゴニストのイソプロテレノール（cAMP濃度を上昇させると予想される）は報告の濃度では侵入に影響しなかったが、イソプロテレノールによるcAMP濃度の上昇を増強すると予想されるホスホジエステラーゼ阻害剤IBMXの共存により原虫の侵入は抑制された。この結果は、昨年度の我々のデータと矛盾しないものであった。先行研究と異なる結果が得られた理由については検証中であるが、少なくとも我々の実験条件においては赤血球内cAMP濃度の上昇をもたらすような変化は原虫の侵入を抑制することが確認できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
昨年度に得られた結果が当初の仮説とは逆であったため、研究計画の大幅な見直しが必要になったことに加え、新校舎への移設に伴い、実質2-3ヶ月の間、実験を中断せざるを得なかったため。
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| 今後の研究の推進方策 |
1）現在までに確認できている、Sp-cAMP、IMBX、フォルスコリンによる原虫侵入抑制効果が、赤血球膜タンパク質のPKAリン酸化によるものであることを実証するために、PKI-mにより赤血球のPKAを阻害したときの赤血球膜タンパク質のリン酸化の程度と原虫の侵入の程度との関係を検討する。PKI-mは有機溶媒にしか溶解せず、実験的に使用できる濃度をあまり高めに設定できないため、適切な実験条件を見つける必要があり、現在検討中である。
2）上記1）を実証した上で、薬理的、生理的濃度で赤血球内cAMP濃度を上昇させることができる薬剤ならびに内在性アゴニストについて、イムノブロット解析による赤血球膜タンパク質のPKAリン酸化を指標にスクリーニングを行い、有力な候補について原虫の侵入への影響を評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前年度に当初の仮説とは異なる知見が得られ、それに基づき研究計画を見直した結果、本年度の研究についてはすでに購入済みのあるいは手持ちの研究試薬を用いて遂行することが可能であったため。
見直した研究計画に基づき、薬理的、生理的濃度で赤血球内cAMP濃度を上昇させることができる薬剤ならびに内在性アゴニストについて、イムノブロット解析による赤血球膜タンパク質のPKAリン酸化を指標にスクリーニングを行い、有力な候補について原虫の侵入への影響を評価する。研究費は主にスクリーニングに供する試薬の購入に使用し、その他必要なプラスチック実験器具等の購入に充てる。
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