| 研究課題/領域番号 |
18K08457
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| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
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研究代表者 |
吉河 智城 国立感染症研究所, ウイルス第一部, 主任研究官 (20399463)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 組換えウイルス / BAC |
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| 研究実績の概要 |
本年度は外来遺伝子を簡単かつ速やかに組込み可能な改良型m8-BACシステムの確立を行った。計画ではワクシニアウイルスLC16ｍ8株の全遺伝子を保持するBACプラスミド（pLC16m8.8S-BAC）内のA40R遺伝子とA41L遺伝子、A46R遺伝子とA47L遺伝子、B16R遺伝子とB17L遺伝子の間に抗生物質耐性遺伝子（カナマイシン、アンピシリン、又はゼオシン耐性遺伝子）を単独、又は内二種類、又は全て組込んだプラスミドを作製する予定であったが、このシステムを拡張し、蛍光遺伝子（緑色蛍光を発するEGFP、赤色蛍光のmApple、又は黄色蛍光のmKusabira oragne遺伝子）を抗生物質耐性遺伝子と同時に発現するシステムとなるように改変を行った。組み合わせはカナマイシン耐性遺伝子とEGFP遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子とmApple遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子とmKurabira orange遺伝子とした。これにより作成されたBACプラスミドを保持する大腸菌は抗生物質耐性の表現系だけでなく蛍光により選択可能だと考えた。実際にpLC16m8.8S-BACのA46R遺伝子とA47L遺伝子の間にRed/ET相同組換え法によりアンピシリン耐性遺伝子とmApple遺伝子を導入したところ、組換えの起きたBACプラスミドを保持する大腸菌のコロニーはアンピシリン耐性かつ、LEDトランスイルミネーター上で赤色の蛍光を発していることが確認できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現時点でA46R遺伝子とA47L遺伝子の間にアンピシリン耐性遺伝子とmApple遺伝子を導入する事が出来ている。A40R遺伝子とA41L遺伝子、B16R遺伝子とB17L遺伝子の間に導入予定である、カナマイシン耐性遺伝子とEGFP遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子とmKurabira orange遺伝子をそれぞれ保持するプラスミドは既に作製済みであり、これをPCRで増幅したものをアンピシリン耐性遺伝子とmApple遺伝子の時と同様にRed/ET相同組換え法により導入すれば良いため、成功する確度は高いと考えている。その為、短期間で、改良型m8-BACシステムを確立出来ると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き改良型m8-BACシステムの確立を目指す。また、本システムを用いて同時にラッサ遺伝子の核タンパク質（NP）、膜糖タンパク質（GPC）、そしてマトリックスタンパク質（Z）の遺伝子を単独、又は複数pLC16m8.8S-BACに導入する。作製したBACプラスミドからラッサウイルスの各遺伝子を発現する、感染性を持つ組換えLC16ｍ8をリカバリーする予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
改良型m8-BACシステムの確立を行う上で、当年度に於ける物品費の支出を請求額まで必要とせずに行うことが出来た。翌年度では作製した組換えウイルスを動物実験に使用するなど、物品費などがより必要となるため、それに使用する。
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