研究課題/領域番号 |
18K08491
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研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
研究代表者 |
藤本 啓 東京慈恵会医科大学, 医学部, 准教授 (40372974)
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研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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キーワード | グルカゴン / 膵α細胞 / PKCδ |
研究実績の概要 |
細胞レベルの実験ではマウス膵α細胞株であるαTC1細胞を用い、高/低グルコース、パルミチン酸添加(インスリン抵抗性惹起)条件にてPKCδ特異的阻害薬であるRottlerin、PKC活性化薬であるPMAを添加しグルカゴン分泌を評価したが、PKCδが関与するという有意な結果を得ることはできなかった。RottlerinはPKCδの特異的阻害薬であることに否定的な論文もあり、現在はPKCδをノックダウン(レンチウイルス、siRNA)しグルカゴン分泌の評価を行っている。昨年も論じたようにαTC1細胞は様々な論文にて一定の見解が得られておらず現段階ではこの細胞株を用い本研究を進めていくことは難しい可能性がある。 生体レベルの実験ではGlucagon-CreマウスとPKCδfloxマウスを交配し膵α細胞特異的PKCδKOマウスの作製、樹立証明を行った。① 遺伝子レベルではgenotypingにて樹立確認ができたものの、②蛋白レベルでは膵切片におけるPKCδの染色ができず、tdTomato等のレポーター遺伝子を用い間接的に同マウスの樹立を確認するに至った。しかし、今回作製したマウスではノックアウト効率が最大50%であることが判明したため、新たにGlucagon-CreERマウスを導入、これによりほぼ100%近いノックアウト効率が達成できた。現在は同マウスにおいてIPGTT、ITTでの血糖やグルカゴンの評価を行っている。また同マウスでの膵切片を作製し膵α細胞数や大きさの評価を今後行う予定である。加えて、可能であれば樹立証明として③mRNAレベルでの証明(tdTomatoで標識された膵α細胞をフローサイトメトリー、セルソーターにて回収しqPCRにてノックアウトを確認)を予定している。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
①膵α細胞に適した細胞株が存在しない。膵α細胞の細胞株は下記に示すようにαTC1細胞、HIT T15-G細胞、InR1G9細胞の3種類が存在している。αTC1細胞はがん遺伝子であるSV40が遺伝子導入されグルカゴノーマより樹立された。SV40はがん抑制遺伝子であるp-53やRbといった分子に結合し不活化することで細胞増殖を促進させる。近年、このSV40の存在が細胞の分化を抑制してしまうため細胞株が本来の純粋な細胞を模倣しない可能性が言われており、やはりαTC1細胞もその可能性は否定できない。またHIT T15-G細胞やInR1G9細胞はもともとインスリノーマ由来の細胞から樹立されており、これらもグルカゴンは分泌しているものの純粋なαTC1細胞を模倣しているか疑問である。つまり、現段階では適した膵α細胞株が存在していない状態である。 ②膵切片の免疫染色でPKCδの染色に再現性が得られていない。DAB染色では膵島周囲に優位にPKCδの染色がみられたが、蛍光免疫染色では染色される場合とされない場合と現在再現性に乏しい状態である。また膵島の染色は非特異的な染色が出やすいといわれており、今回染色されたものも本当にPKCδであるかが疑わしい。 ③作製したマウスのノックアウト効率が最大50%であった。Glucagon-Creマウスのノックアウト効率が低くノックアウト効率を上げるべくGlucagon-CreERマウスの交配を追加する必要があったため。
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今後の研究の推進方策 |
細胞レベルの研究 ①Ex vivoとしてIsletを用いた研究を行う。しかしβ細胞も共存するためインスリンの影響を考えなくてはならない。インスリンは膵α細胞グルカゴン分泌の抑制因子とされる。一説には中和抗体を用いることでインスリンの影響をキャンセルできる可能性もある。②PKCδをレンチウイルスやsiRNAにてノックダウンしPKCδのグルカゴン分泌への評価を行う。③新しい膵α細胞株の作製を行う。
生体レベルの研究 ①膵α細胞特異的PKCδKOマウスの樹立証明とcharacterizationを行う。①樹立証明にはtdTomatoで標識された膵α細胞をフローサイトメトリー、セルソーターにて回収しqPCRにてノックアウトを確認する(mRNAレベル)。これにはviabilityの問題が伴う。②PKCδの免疫染色も引き続き検討していく。③同マウスのcharacterizationとしてIPGTT、ITTでの血糖やグルカゴンの評価を行っている。また同マウスでの膵切片を作製し膵α細胞数や大きさの評価する。
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次年度使用額が生じた理由 |
細胞レベルでの実験が膵α細胞に適した細胞株がなく一定期間研究が滞ったため。 加えて、作製した膵α細胞特異的PKCδノックアウトマウスのノックアウト効率が低く、より高いノックアウト効率の高いマウスを作製するためGlucagon-CreERマウスの導入に時間を要し、こちらも一定期間研究が滞った。 次年度はレンチウイルス、siRNAでの研究を進め、その実験の消耗品等で当該金額を使用する。またマウス維持や学会等への参加・発表に対しても当該金額を使用する。
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