| 研究課題/領域番号 |
18K08528
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
上野 隆 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員教授 (10053373)
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| 研究分担者 |
數野 彩子 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (00338344)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | β-アラニン / ピリミジン代謝 / リソソーム / ウレイドプロピオン酸 / ウレイドプロピオナーゼ / アミノ酸 / オートファジー |
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| 研究実績の概要 |
タンパク質がオートファジーやヘテロファジーで分解されて生成するアミノ酸はリソソームに蓄えられ代謝的に利用される。肝臓のオートファジーによって生成するアミノ酸を調べる過程で、リソソームにタンパク分解で生成したアミノ酸以外に非タンパク性のβ-アラニンが多量に存在することを見出した。β-アラニンはピリミジン異化代謝で生じるウレイドプロピオン酸（UPA）を経由して作られる。細胞でどのようにしてβ-アラニンが作られリソソームに濃縮されるか、また、β-アラニンがどのように代謝されるのかを明らかにするのが本研究課題である。平成30年度に以下のことを明らかにした。
１．肝臓以外のマウス胚性線維芽細胞（MEFs）やHepG2で細胞分画を行い、β-アラニンを定量したところ、リソソーム画分に再現性良く回収されることが判明した。さらに細胞内β-アラニン量を測定したところ、飢餓条件で富栄養条件に比べて有意に増えることが解った。
２．β-アラニン生成の最終ステップを司るウレイドプロピオナーゼ（UPB1）の組織や細胞内分布を調べ、マウス組織では肝臓に圧倒的に多い一方、培養細胞ではHepG2, Huh7、C2C12、HeLa、podocyteなどに広く発現することが解った。HepG2を用いてさらに分画遠心を行ったところ、リソソーム画分にUPB1が検出されることから、リソソームにβ-アラニン合成系の最終ステップが局在している可能性が示唆された。
３．様々な培養細胞で培地に加えたβ-アラニンが細胞内へ取り込まれるかを検討した。その結果遊離のアミノ酸としては取り込まれにくく、メチルエステルやエチルエスエルとして加えたときのみ細胞内β-アラニン量が上昇ることを見出した。本研究課題が採択される以前に投稿した総説がβ-アラニンを貯留するオートリソソームの精製法について述べているので、これを30年度業績として計上する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
１．ラットやマウスから分離精製した（オート）リソソームにβ-アラニンが貯留することに鑑みて、β-アラニンを細胞質からリソソームへ輸送するシステムが働いていると考えられるが、この輸送系の証明はまだ道半ばで達成できていない。in vitroβ-アラニンの輸送活性測定には高純度のリソソームを分離する必要が有るが、動物の肝臓からのリソソーム分離には丸1日を要するので、培養細胞を使って検討中である。パーコールやOptiPrepの密度勾配遠心によって目的に適う標品を得られるようになってきた。
２．リソソームに貯留するβ-アラニンは、in vivoではウラシルからウレイドプロピオン酸（UPA）を経て作られる。UPAからβ-アラニンを生成するウレイドプロピオナーゼ（UPB1）は培養細胞に広く発現していることから、培地にUPAやさらにその前駆体であるウラシルを加えることによって細胞内β-アラニンレベルの上昇が起こると仮定して調べているが、これまでのところβ-アラニンが増えるという結果にはなっていない。ウラシルやUPAが細胞形質膜不透過性である可能性も除外できないので、細胞内無細胞抽出液でのin vitro酵素反応実験を行う余地がある。
３．上述の２に代わる手立てとして、β-アラニンのメチルエステルやエチルエステルを加えて直接細胞内へ取り込ませ、エステラーゼの働きによって細胞質内で遊離したβ-アラニンがリソソーム画分に取り込まれるかどうかを現在検討中。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．高純度リソソームを用いてin vitroでのβ-アラニン輸送反応を解析する。ATP存在下あるいは非存在下に14C-β-アラニンとリソソームを一定時間インキュベートし、リソソーム小胞をグラスフィルターに濾過し、フィルター上にトラップされる14Cの放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定する。さらにプロトノフォアであるバフィロマイシンA1やナイジェリシンによって取り込み活性が阻害されるかどうか調べる。動物のリソソームアミノ酸輸送系はいくつかのグループが知られていて、その中にβ-アラニン輸送を担うものが有るとすれば、グループ特異的な阻害剤の効果によって輸送系が確定する可能性が有る。実験材料となるリソソームは培養細胞から分離するが、最近簡便に純度の高いリソソームを分離するキットがいろいろ販売されているので、必要ならこれらのキットを利用する。また、それでも不十分な場合はマウスの肝臓からリソソームを精製してこれを用いる。
２．β-アラニンの出発材料であるウラシルはRNAの分解産物であり、細胞内RNA分解の主要経路の一つはオートファジーである。高いオートファジー活性を保有する培養系ではオートファジー活性に相関して細胞内ウラシルレベルが変動し、それが細胞内β-アラニン量の変動として反映されるかも知れない。オートファジーを誘導する飢餓条件や、オートファジー阻害剤存在下で、細胞内引いてはリソソームのβ-アラニン量がどのように変化するかを調べる。一方、動物細胞でβ-アラニンがピリミジン異化代謝で生成する以外に他のアミノ酸から作られる経路が存在するかどうかも興味深く、これについても検討したい。
β-アラニンを材料として代謝される生理活性物質としてカルノシンが有る。カルノシンは抗酸化作用や骨格筋収縮を活性化させる働きが有ると言われるがその機構は解っていない。このテーマにも取り組みたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
試薬の価格を想定外に高く見積もってしまい、最終的には余ってしまった。次年度に確実に支出できる範囲である。
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