| 研究課題/領域番号 |
18K08528
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
上野 隆 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員教授 (10053373)
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| 研究分担者 |
數野 彩子 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (00338344)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | リソソーム / β－アラニン / カルノシン / ウレイドプロピオン酸 / ウラシル / イミダゾールジペプチド / ウレイドプロピオナ－ぜ |
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| 研究実績の概要 |
非タンパク性のアミノ酸であるβ－アラニンは、ピリミジン（ウラシル）分解の代謝中間体であるウレイドプロピオン酸（UPA）を前駆体としてウレイドプロピオナ－ゼ（UPB1）の働きによって作られる。β－アラニンから作られるカルノシンやアンセリンはイミダゾールペプチドとして知られ、筋収縮を活性化するなどの生理活性を有し栄養学的な意義が高い。ラットやマウスの肝臓のリソソームにタンパク分解で生成した20種類のアミノ酸に加えてβ－アラニンが多量に含まれることに着目し、ピリミジン代謝で生成したβ－アラニンがβ－アラニン特異的あるいは他のアミノ酸と共通の輸送システムでリソソームに貯留すると仮説を立て、これを検証するのが本研究目的である。20年度では以下に述べるような解析を行った。
１．肝細胞系の培養細胞であるHepG2やBRL (buffalo rat liver)を用いて、前駆体であるウラシルやUPAからβ－アラニンが生成される代謝過程を細胞内遊離アミノ酸分析で調べた。1 mMのウラシルやUPAを培地に加えて24時間培養した細胞内のβ―アラニン量は対照に比べて若干（~20%）増えるのみで、ピリミジン代謝でβ－アラニンが生成する反応は極めて遅く、リソソームのβ－アラニン量を説明するには長時間の代謝反応を要すると考えられた。一方、培地に加えたβ－アラニンは速やかに細胞に取り込まれること、マウスやラットの餌にはβ－アラニンが豊富に含まれることから、餌に含まれるβ－アラニンがエンドサイトーシスによって動物の肝リソソームに取り込まれる可能性も考えられる。
２．１と関連してUPB1の組織・細胞分布をウェスタンブロットで調べた。UPB1は多くの細胞や組織に遍く分布することが判明した。また、細胞分画ではサイトゾルに大部分が回収されるが、一部がリソソーム・ミトコンドリア画分にも分布することが分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
リソソームに貯留するβ－アラニンがピリミジン代謝によって生成する道筋を証明することが困難であることに鑑み、β－アラニンのリソソームへの輸送を直接証明する実験に切り替え、準備実験を行っている。マウスやラットからリソソームを分離して輸送活性を測定することは大掛かりで時間を要するので、まず培養細胞を用いて検討した。ディッシュに生着した培養BRL細胞をトリプシン処理して浮遊させ、遠心回収した細胞を26ゲージの注射筒を通してライセートし、ここからミトコンドリア・リソソーム（ML）画分を分離して、さらにOptiPrepやPercollの密度勾配遠心を行い高純度のリソソームを単離する方法を確立した。リソソームをMg-ATP存在下に14C－β－アラニンとインキュベートし、反応液を素早く15,000Xg, 5分遠心して沈殿のリソソームの放射活性を測定することでβ－アラニン輸送活性を表すことが可能である。この輸送活性に及ぼす他のアミノ酸の影響などをさらに調べたい。
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| 今後の研究の推進方策 |
β－アラニンのリソソームへの能動輸送系が確立されれば新しい発見と評価される。おそらくリソソームがβ－アラニンの生理的なプール、あるいはリザーバーとしての役割を担い、必要に応じてカルノシン生成の材料として供給される意義があると考えられる。代謝とリンクした輸送系という側面をさらに明らかにする意味で、リソソーム画分に局在するUPB1に注目して行きたい。リソソーム近傍での微小環境でのピリミジン分解と生成物β－アラニンのリソソームへの輸送という興味深い発見につながるかもしれない。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナ・パンデミックに伴う緊急事態宣言下で2020年3月から6月まで実質的に実験ができず、研究進捗に大幅な遅れをとった。このため繰越手続きをとって2021年度を最終年度としてさらに研究課題を遂行して結論を出せるようにしたい。
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