| 研究課題/領域番号 |
18K08535
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
齋藤 武 千葉大学, 大学院医学研究院, 准教授 (20406044)
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| 研究分担者 |
幡野 雅彦 千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (20208523)
吉田 英生 千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (60210712) [辞退]
坂本 明美 千葉大学, バイオメディカル研究センター, 准教授 (90359597)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 制御性T細胞 / 細胞性免疫 / オートファジー / ウェスタンブロッティング / 電子顕微鏡 |
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| 研究実績の概要 |
2018年度は、健常児3名(各2, 5, 8歳)の血液サンプル2-3mlを用い、各T細胞分画のsortingをflowcytometryと免疫磁気ビーズで試みた。CD3, CD4, CD8分画は識別可能であり、各10.3±4.6％, 7.5±3.3％, 3.4±2.4％であった。現在CD4, CD8分画を、CD45とCD62Lを用いてナイーブ細胞、central memory subset、effector memory subsetに分別することを試みているが、収集効率が不安定である。成人血液検体を用いることで、実験系の確立を目指す。
並行して、成人CD3, CD4, CD8分画のオートファジー機能を検証している。各分画細胞抽出液を用い、ウェスタンブロティング法にてLC3-Ⅱ(lipidated form of microtubule-associated protein 1 light chain 3)とp62発現量を調べた。再現性を確かめ、BAを含む小児例で同実験を試みる。
一方、BAのTreg機能検証実験を継続しており、今年度はTreg specific demethylation region (TSDR)と免疫染色実験の系を確立した。前者ではメチル・非メチル化特異的probeと、両者の共通のプライマーを設計した。TSDRを含む人工遺伝子を作成し、脱メチル化率0％と100%のサンプルを得、希釈列よりqPCRのstandard curveを作成した。後者では、CD4とFoxp3の蛍光染色の条件を検討した。Positive controlとして先天性胆道拡張症と肝芽腫のパラフィンサンプルを用い、染色条件を検討し、胆管周囲と腫瘍内のCD4+Foxp3+細胞(Treg)を検出した。両実験とも、今後BA検体を用いて、本実験を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
2018年度は血液サンプルを用い、各T細胞分画のsortingを試みた。CD3, CD4, CD8分画は識別可能で分離抽出できたが、後者二つをナイーブ細胞、central memory subset、effector memory subsetに選別する過程で進捗が遅れている。理由は、選別に有用とされる表面マーカーCD45とCD62Lが結合する細胞数が絶対的に少ないことに由来すると想定される。大本の血液量を増やしつつ、実験系を見直し、精度を改善している最中である。成人では血液5mlから、ナイーブ細胞、central memory細胞、effector memory細胞が安定して採取できており、今年度は対象を小児に移行する。
ウェスタンブロティング法についても、現時点では成人健常者検体を用いている。autophagyの指標として頻用されるLC3-Ⅱとp62の発現はほぼ一定して確認できており、実験系はおおむね確立できたと判断している。今後これを小児健常者に適用し、定常状態における小児例のそれを検証する。
また、TSDR実験開始当初は、既報の条件を用いてもqPCRが機能せず、諸条件の検討を要したため、進捗はやや遅れている。免疫組織染色では、肝臓の実質組織の自家蛍光が強く、低減法に難渋したが、現在CD4, Foxp3の二重蛍光免疫染色の実験系は確立できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
2019年度は、小児のBA/non-BA患児で、T細胞全般(CD3)とhelper/細胞障害性/制御性/ナイーブ/メモリーT細胞分画を選別・抽出する。その多寡を検討した後、各分画のオートファジー活性を検証する。活性を変動させるファクターとして、anti-CD3-CD28を投与したり1%FBS下で培養したり(飢餓状態と解釈されるオートファジー誘発因子)する。これら外的要因に対するオートファジー活性の変化率を、両群で比較する。本実験でも実験系が安定するまで試行錯誤することが予想され、適宜、成人血液を用い実験系の妥当性を評価する必要がある。
また電子顕微鏡でも当該細胞のオートファジー能を評価する。一般に細胞内のautophagic vacuoles の大きさ・数・分布は活性を示すとされる。よって各T細胞50細胞当たりのvacuoles を数え、平均size を計測し、さらに3個以上のvacuoles を有する細胞数を算出する。これも外的因子で刺激し活性の変化率をもとめ、BA群とnon-BA群で比較する。
TSDR実験では、脱メチル化率を細かく設定した希釈系列と、健常人CD4+T細胞より抽出したDNAを用い、至適qPCR条件を追求する。今後、蓄積した患者検体でCD4+T細胞中のTregの多寡をqPCRで測定する。新規患者のサンプル収集を継続しつつ、肝検体に本法を応用する。結果、局所の機能性Tregを定量することが可能となり多角的評価が可能となる。免疫組織染色では、患者検体を用いて本実験を行う。Tregの機能分子であるTGF-β, IL-10, CTLA-4を共染色し、BAとnon-BAを比較することで、BAの病因・病態形成における局所Tregの意義を検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度実験試薬類を購入する際に生じた端数である。次年度使用するの備品類の購入に充てる予定である。
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