透明化組織イメージング法を用いたヒルシュスプルング病の新しい診断マーカーの探索

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K08601
• 研究機関: 順天堂大学
• 研究代表者: 宮原 克 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 技術員 (00420844)
• 研究分担者: 藤原 なほ 順天堂大学, 医学部, 非常勤講師 (20589543) ; 山高 篤行 順天堂大学, 医学部, 教授 (40200703) ; 田中 奈々 順天堂大学, 医学部, 准教授 (50530656)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: ヒルシュスプルング病 / 透明化組織イメージング / バイオマーカー

研究実績の概要

ヒルシュスプルング病(H病)は先天性に腸管神経系が欠如する疾患であり、その原因として様々な遺伝子の変異が明らかになってきている。しかし本研究課題の目的である、H病根治術の際に正確に病変領域を特定するためのマーカーに関する報告は決して多くない。今年度は現在用いられているいくつかの神経組織マーカーを使用した３次元イメージングの手法によるH病腸管正常部、移行部、病変部それぞれの領域における神経マーカーの発現分布の可視化を試みた。
SeeDB法による透明化処理を施したH病モデルマウスの無神経節部腸管領域の異常増生する外来神経が①マウス胎生期において身体のどの部位から生じどのように増生するのか、②それらの増生神経はどのような神経成分を含んでいるか、の2点の確認を試みた。
まず①増生神経線維の発生に関しては神経堤細胞マーカーSox10に加え平滑筋マーカーα-SMAを染色し、腸管の部位を特定しどの部位から増生神経が生じているかを明らかにした。今回の検討ではマウス胎仔を用いて共焦点顕微鏡による深部イメージングにより検討を行ったが、すでにこの時期において腸管に侵入する外来神経は正常比較群マウスに比べ明らかに増生していることが確認できた。
②の増生神経の神経成分を明らかにする試みは生後1週間のモデルマウス腸管組織をwhole mount 染色法による神経細胞マーカーTuj-1とグリア細胞マーカーS100βにより免疫染色を行い、共焦点顕微鏡で撮影した。それぞれの神経マーカーの発現は予想とは違う結果が観察されたが、現在用いられている診断マーカーの有用性を検討するために、または新規バイオマーカー探索のために今年度の結果は役立つものと考えている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

胎生期の増生神経分布を遺伝子改変モデルマウスでの透明化組織イメージングにより視覚化できた。腸管に入る仙骨神経堤由来の神経線維がどのような神経マーカーを発現しているか、また腸管に投射する神経線維が腸管外から侵入する段階で増生していることが判明した。この結果は次年度以降で計画している、様々な抗体を用いて検討する診断マーカーを探索するための有用な結果であると考えられるため。

今後の研究の推進方策

仙骨神経堤由来の神経堤細胞群が移動しながらどのように神経線維増生していくか、今年度のニューロンマーカー、グリア細胞マーカーの観察結果を目印にして分化過程でどのように神経細胞が異常に突起を伸ばすかに注目して研究する。またどのように増生神経線維束が形成されるかを腸管内血管形成との関連に注目して、結果として血管形成にかかわる因子が病態に関連するか否かにも注目して研究を進めていく。

次年度使用額が生じた理由

必要な物品を購入する際、合計金額が残りの4円を満たすような組み合わせでの購入ができなかったため。

研究成果

• [雑誌論文] DPP4 inhibitor reinforces cell junction proteins in mouse model of short bowel syndrome. (2020)
  • 著者名/発表者名: Sueyoshi R, Miyahara K, Nakazawa-Tanaka N, Fujiwara N, Ochi T, Yamataka A.
  • 雑誌名: pediatric surgery international 巻: 36(1) ページ: 49-55
  • DOI: 10.1007/s00383-019-04571-5
  • 査読あり
• [雑誌論文] Decreased expression of β1 integrin in enteric neural crest cells of the endothelin receptor B null mouse model. (2020)
  • 著者名/発表者名: Nakazawa-Tanaka N, Miyahara K, Fujiwara N, Ochi T, Sueyoshi R, Nojiri S, Akazawa C, Urao M, Yamataka A.
  • 雑誌名: pediatric surgery international 巻: 36(1) ページ: 43-48
  • DOI: 10.1007/s00383-019-04578-y
  • 査読あり
• [雑誌論文] Endothelin receptor B affects the perfusion of newborn intestine: possible mechanism of necrotizing enterocolitis development (2019)
  • 著者名/発表者名: Miyake H, Seo S, Fujiwara N, Miyahara K, Lee C, Li B, Chen Y, Yamataka A, Pierro A.
  • 雑誌名: pediatric surgery international 巻: 35(12) ページ: 1339-1343
  • DOI: 10.1007/s00383-019-04559-1
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Role of FBXW7 in the quiescence of gefitinib-resistant lung cancer stem cells in EGFR-mutant non-small cell lung cancer (2019)
  • 著者名/発表者名: Hidayat M, Mitsuishi Y, Takahashi F, Tajima K, Yae T, Miyahara K, Hayakawa D, Winardi W, Ihara H, Koinuma Y, Wirawan A, Nurwidya F, Kato M, Kobayashi I, Sasaki S, Takamochi K, Hayashi T, Suehara Y, Moriyama M, Moriyama H, Habu S, Takahashi K.
  • 雑誌名: Bosnian Journal of Basic Medical Sciences 巻: 8;19(4) ページ: 355-367
  • DOI: 10.17305/bjbms.2019.4227
  • 査読あり