2020 年度実施状況報告書

エクソソーム分泌阻害と抗脈管新生に関わる遺伝子との複合治療による乳癌転移阻止

研究課題

研究課題/領域番号	18K08606
研究機関	大阪医科大学
研究代表者	柴田雅朗大阪医科大学, 医学部, 准教授 (10319543)
研究分担者	伊藤裕子大阪医科大学, その他部局等, 功労教授 (40148432) 谷口高平大阪医科大学, 医学部, 講師 (70779686)
研究期間 (年度)	2018-04-01 – 2022-03-31
キーワード	nSM2 / siRNA / miRNA / 乳癌 / 転移
研究実績の概要	2019年度まで、構築したpAAV-U6-ZsGreen1 Vectorを用いたnSM2-siRNA発現ベクターが上手く働かず、2020年はベクターをpBsi-mU6に変更し、再構築を行った。その結果、乳癌細胞株において、nSM2発現の有意な抑制効果が発揮されたが、細胞のエクソソーム分泌量は約40％の低下をみるのみであった。 nSM2阻害剤GW4869の投与実験では、BJMC3879Luc2移植乳癌に対して、週2回の割合で計4回、2.5mg/kgを腫瘍内に直接、注射し、屠殺剖検した。なお、対照群には生理食塩水のみを同様に投与した。その結果、経時的な腫瘍体積で対照群との間に差異を認めず、リンパ節の転移個数においても差が示されなかった。 miRNAとの複合投与による転移抑制の増強を計画していたことより、miR-Xをその候補とした。このmiR-XはMAPK/ERK経路およびPI3K/Akt経路を抑制することから、抗脈管新生作用を有すると考えられ、腫瘍内投与による予備実験を行った。その結果、腫瘍径では、1000 nM群において、遺伝子導入の7日後に有意な抑制が示された。引き続き、1000 nM群で本実験を行った結果、有意な転移抑制は観察されなかった。いずれの実験でも良好な結果が得られず、現在はnSM2-siRNA発現ベクターを安定的に組み込んだBJMC3879Luc2乳癌細胞株を作製しており、これを移植することによりnSM2低下により乳癌転移がどう変化するかを解析する。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 4: 遅れている理由 nSM2-siRNA発現ベクターの構築が上手くゆかず、ベクターを変え再構築した。その結果、nSM2 mRNAでは有意な低下を見たが、エクソソーム分泌量をELISAで解析すると約40％程度の抑制をみるにとどまり、これでは転移抑制に至るには不十分と考え、nSM2阻害剤であるGW4869の投与実験を行った。 nSM2阻害剤のGW4869を2.5mg/kg の容量で腫瘍内に直接、投与した結果、腫瘍増殖にも転移に対しても抑制が示されなかった。 nSM2を抑制するとともにmiRNAを複合投与することで、転移抑制の増幅効果を期待し、miR-Xの1週間の予備実験を行った。腫瘍内に直接、Lipofectamineと共に注射した結果、有意な腫瘍体積の抑制とPCNAを指標とした細胞増殖の抑制が観察された。そこで、投与期間6週間の実験を行った結果、5週まで有意な腫瘍増殖の抑制を見たものの、6週では有意差はなくなった。リンパ節転移では群間に差異は観察されなかった。いずれの実験でも良好な結果が得られず、現在、nSM2-siRNA発現ベクターを転移性の乳癌細胞に組み込み、安定的にnSM2を抑制する細胞株を作製している。この乳癌細胞株を移植し、恒常的なnSM2低下が転移抑制に効果があるかどうかを解析する。
今後の研究の推進方策	現在、nSM2-siRNA発現ベクターを転移性の乳癌細胞に組み込み、安定的にnSM2を抑制する細胞株を作製している。この細胞株におけるnSM2の抑制をReal time RT-PCR解析で確認の上、この乳癌細胞株を移植し（対照群にはnSM2-siRNAを導入していない細胞）、移植後2週より、腫瘍径を6週間計測する。また、移植後8週の時点で生体発光イメージングを行い、腫瘍の拡がりを観察する。その後、屠殺剖検し、移植腫瘍、腋窩リンパ節や鼡径リンパ節のほか、全身諸臓器を摘出し、ホルマリン固定する。病理組織標本の作製を行い、転移抑制の有無を解析する。さらに、nSM2免疫組織染色とFFPEからのReal time RT-PCR解析でnSM2の抑制を再度、確認する。腫瘍径や転移抑制が観察された場合は、さらに腫瘍細胞での細胞増殖率、血管新生、リンパ管新生、アポトーシスについて解析し、nSM2抑制がもたらす効果を検討する。
次年度使用額が生じた理由	実験が上手く行かなかったために、最終年度内に間に合わず、期間延長をした。遺伝子導入した癌細胞を作製しており、移植実験するための動物費用に充てる。