2018 年度実施状況報告書

エクソゾームを利用した膵癌幹細胞標的療法の開発

研究課題

研究課題/領域番号	18K08627
研究機関	鹿児島大学
研究代表者	松原修一郎鹿児島大学, 総合科学域総合研究学系, 准教授 (60199841)
研究分担者	新地洋之鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (60284874) 高尾尊身鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 客員研究員 (80171411)
研究期間 (年度)	2018-04-01 – 2021-03-31
キーワード	癌幹細胞 / 膵臓癌 / CD133 / エクソゾーム / microRNA / 繊維化 / mTOR / KRAS
研究実績の概要	近年エクソゾームに関する研究が進み、この膜小胞に含まれる様々の分子が体内において安定であること、また、膵癌などKRASが活性化した細胞ではエクソゾームの取り込みが亢進していること、が報告されている。さらに、エクソゾーム(ならびにこれに含まれる生体分子)がバイオマーカーとして有用であることが、広く知られるようになってきた。本研究では、これらに着目して、i) 膵癌幹細胞の生成するエクソゾームの特徴を明らかにするとともに、ii) エクソゾームの運搬体としての有用性を検討し、膵癌幹細胞制御の新たな方法を探る。具体的な方法としては、我々の樹立した癌幹細胞モデルであるCD133陽性膵癌細胞を用い、この細胞にCD133shRNAを安定発現させて得たノックダウン細胞と比較することによって実験をおこなう。今年度は、まずこれらの細胞が細胞外の環境にどのように作用するかを調べるために、免疫不全マウス(ヌードマウス)の膵臓に同所移植し、腫瘍を形成させる実験をおこなった(in vivoの系)。両者から得られた腫瘍の切片を作製し組織化学的に検討をおこなった結果、CD133陽性細胞の腫瘍では腫瘍周辺組織の線維化が促進され、また、マクロファージの浸潤が亢進することがわかった。すなわち、CD133の発現は細胞外の組織や細胞に作用を及ぼすことが確認された。そこで、その機序を明らかにするためin vitroの系を用いた解析に着手した。また、エクソゾームを運搬体とした短鎖RNA導入によって膵癌幹細胞の抑制を行う際に標的となる遺伝子を調べる目的で阻害剤を使った実験をおこない、mTOR複合体1と同時にmTOR複合体2を阻害することが、幹細胞性の抑制に有効であることがわかった。mTOR複合体2は、KRASの下流でAktの活性化に関与し、Akt- mTOR複合体1の経路に寄与するものと考えられた。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由今年度は、1)CD133陽性モデル細胞(膵癌幹細胞様細胞)とCD133ノックアウト細胞の産生するエクソゾームの比較解析、2)これらの細胞が周辺組織に及ばす影響、および、3)膵癌幹細胞の抑制に効果的な標的シグナルの解明、4)膵癌幹細胞の抑制に効果的なmiRNA配列の検索を計画した。 2)については、両方の細胞を免疫不全マウス(ヌードマウス)の膵臓に同所移植し、腫瘍を形成させて組織化学的に検討した結果、CD133陽性細胞の腫瘍では腫瘍周辺組織の線維化が促進されることがわかった。したがって、CD133の発現は膵癌細胞の状態を変化させ、周辺の細胞に異なった作用を及ぼすと判断される。このしくみを明らかにするために、次にin vitroの細胞培養系を用いて繊維芽細胞やマクロファージに対する作用の違いをみているが、現在まだ結果が得られていない。両者の放出するエクソゾームに違いがあり、これが周辺組織の線維化に関与している可能性が考えられるので、1)の結果が待たれるがこれについても方法の確認をおこなっている段階である。膵癌ではほとんどの症例でKRASの活性化突然変異があることが知られており、また、KRASに対するsiRNAの投与が治療に有効であることが報告されている(マウスモデル)。いっぽうで、KRAS活性の抑制は、標的療法に用いるエクソゾーム(短鎖RNAのベクター)の取り込みを抑制する可能性があり、新たな標的遺伝子の検討をおこなっている。我々は、RAS下流のAkt⇒mTOR経路に注目しているが、阻害剤を用いた実験からmTOR複合体1および2を同時に阻害することが幹細胞性の抑制に有効であることがわかった。これを含めて候補となる短鎖RNA(siRNA、miRNA)のリストを作成し、実際にモデル細胞に導入し検討しようとしているが、現在導入効率に問題があり進行が遅れている。
今後の研究の推進方策	CD133陽性膵癌細胞とCD133ノックアウト細胞の周辺細胞への作用については、今後もin vitroの細胞培養系を中心に、細胞学的手法(生理活性の検討)と分子生物学生化学的手法(成分の比較解析)の両面から検討する。現在の方法論的問題については、この方面の実験に実績のあるグループに指導を受ける。短鎖RNA(siRNA、miRNA)の導入効率の問題については、導入効率を可視化できるレポーター系を用いて、導入条件の最適化をはかる。KRAS以外に有効と判断される標的遺伝子がみつかれば、これの発現ベクターを作製し、エクソーム発現用細胞に組み込む。
次年度使用額が生じた理由	CD133陽性細胞とCD133ノックアウト細胞の産生するエクソゾームの解析と単鎖RNAの導入法に技術的問題があり、計画にやや遅れが生じている。エクソゾームの解析については、経験のあるグループから助言を受けて技術的解決を図るとともに、膵癌側だけでなく、組み換えエクソゾーム産生細胞も同時に解析する。RNAの導入法については、本研究課題において重要な問題なので、導入効率を可視化できるシステムを取り入れ根本的な解決を図る。エクソゾームは最近急速に進展し始めた研究分野であり、研究方法などについても現在学会その他を通して標準化がすすめられている。また、次々と新しいデータが報告されておりこれに対応することが重要となっている。したがって、経費の使用計画としては上記の実験を推進するための物品費などに使うとともに、積極的に国際学会などに出席し情報を集めるための参加費や旅費としても使用する。