| 研究課題/領域番号 |
18K08627
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
松原 修一郎 鹿児島大学, 医学部, 客員研究員 (60199841)
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| 研究分担者 |
新地 洋之 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (60284874) [辞退]
高尾 尊身 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 客員研究員 (80171411)
下野 隆一 香川大学, 医学部, 准教授 (60404521)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 癌幹細胞 / 膵臓癌 / CD133 / エクソゾーム / mTOR / KRAS / Akt / マクロピノサイトーシス |
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| 研究実績の概要 |
我々は膵癌細胞株Capan-1において膜表面分子CD133が癌幹細胞マーカーであることを明らかにし、遊走能を指標に選別を繰り返した結果CD133高発現の亜株Capan-1M9を得た。この細胞を膵癌幹細胞のモデルとして新たな治療法の開発をおこなっている。
一昨年から力点をおいてきた標的分子検索については、上記モデル細胞による実験からKRASシグナルの下流にあるmTORC1(mTOR複合体1)の抑制が有効であることが明らかになり、また、この時フィードバック機構を介してmTORC1の活性化に働くmTORC2(mTOR複合体2)→Akt経路の同時阻害が効果を高めた。
同様の結果を他の膵癌細胞株PANC-1、PCK-2でも得ることができたが、一方でCapan-1においては、mTOR (mTORC1)阻害剤がviabilityを抑制しないという結果が得られた。この結果は重要であるのでこの点についてさらに検討している。実験に用いたCapan-1細胞はCapan-1M9細胞樹立後にATCCより入手したものなので、亜株樹立に用いた細胞との異同を含めて調べている。
膵癌などKRASが活性化した細胞ではエクソゾーム取り込みの亢進が報告されており、siRNAなどの癌細胞への導入にエクソゾームの利用が有効であると考えられているが、アメリカのグループ(Kalluri, R.ら 2017)のようにKRASを直接標的とした場合には、エクソゾームの取り込みも低下する可能性がある。mTORC1、あるいは mTORC1と mTORC2の同時阻害がこれを回避できるか確認するための実験系の準備をおこなっている。また、CD133高発現細胞とCD133ノックダウン細胞でエクソゾームの取り込みに差があるかも調べようとしている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
これまでエクソゾームを利用した標的療法において標的とする分子の検索に力点をおいて研究をすすめてきた。過去の研究において、我々は膵癌細胞の幹細胞性の維持にｍTORおよびGLIを介したシグナルが重要であることを報告している(Matsubaraら2013、Miyazakiら2016)。さらに昨年度までの研究でmTORC1(mTOR複合体1)とAktの同時阻害が膵癌細胞の幹細胞性抑制に有効であることを明らかにすることができた。
よって膵癌幹細胞モデル(CD133高発現膵癌細胞株)に導入し、検定する段階に入っているが、短鎖RNAの導入効率が低いという問題を解決できず、また、エクソゾームを遺伝子導入の手段として利用する方法についてはまだ確立していない。
今年度の研究により親株(Capan-1)に対してmTOR (mTORC1)阻害剤が抑制効果がないということが明らかになりこちらも検討しているため遅れが生じている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の実験は、基本的には、癌幹細胞抑制に用いる短鎖抑制RNAの配列決定とエクソゾームを用いて細胞に作用させる方法の開発に移る。ただしCapan-1細胞に対してmTOR (mTORC1)阻害剤が抑制効果を持たないという点については重要な問題なので、これがCapan-1M9細胞樹立に用いた細胞でも同様なのかをまず明らかにしておきたい。
エクソゾームの分離方法については、まず膵癌細胞(CD133高発現細胞とCD133ノックダウン細胞)で実験し、エクソゾームの性状の確認などもしたうえで、次に投与用エクソゾーム産生細胞からの分離精製をする。
配列決定については短鎖抑制RNAをリポフェクションあるいはエレクトロポレーションを用いて直接導入する条件を検討し、これらの方法で有効な短鎖抑制RNAの具体的配列決定ができるかをまず検討する。これと併行して短鎖抑制RNA配列を発現するコンストラクトを作製し、エクソゾーム産生細胞に導入することによって短鎖抑制RNA導入用エクソゾームをつくる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
武漢肺炎ウイルス(SARS-CoV-2)騒動でいろいろな実験に遅れが生じ、また、これまで実験を進めるのに使用してきた膵癌幹細胞モデル細胞Capan-1M9(亜株)の親株(Capan-1細胞)でmTOR阻害剤の作用が認められなかったことから一部計画を変更したため次年度使用が生じている。これらによって生じた助成金の次年度使用額は、延長期間中におこなうことを計画している癌細胞および正常細胞(治療用エクソゾーム産生細胞)からのエクソゾームの分離、解析実験に使用する。
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