膵癌進展におけるＴＧＦβ－Ｈｉｐｐｏシグナルのクロストークに関する研究

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K08651
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 近本 亮 熊本大学, 医学部附属病院, 准教授 (10419640)
• 研究分担者: 林 洋光 熊本大学, 医学部附属病院, 助教 (80625773) ; 岡部 弘尚 熊本大学, 医学部附属病院, 助教 (40573621) ; 橋本 大輔 熊本大学, 医学部附属病院, 非常勤診療医師 (80508507)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 膵癌 / YAP / TAZ / TGF-beta / 抗がん剤抵抗性

研究実績の概要

保有する膵癌細胞株8株でYAP/TAZの発現状態をwestern blotting法で確認したところ、肝癌細胞株同様にTAZ優位（TAZ>YAP）の発現パターンを8株中7株で呈していた。AsPC-1細胞株ではYAP=TAZ程度の発現状態であった。Smad4の発現についてもwestern blotting法で確認したところ、Smad4発現あり（MIAPaca2, PANC-1, PK59, PK8）とSmad4発現なし（AsPC-1, KLM-1, S2-VP10, S2-013）の株があり、以降のTGF-β添加実験にはAsPC-1, KLM-1, MIAPaca2, PANC-1, PK59を用いることとした。TGF-β添加量の設定を行うために、TGF-βを5ng/mL, 10ng/mL, 15ng/mLで添加し、Smadシグナルの活性化をphospho-Smad3で確認し添加量をTGF-β15ng/mLに設定した。引き続き、TGF-β添加によるYAP/TAZ発現変化ならびにYAPもしくはTAZ発現抑制状態でのTGF-βシグナルの活性化について検討を進める。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

2016年4月の熊本地震による実験施設および多くの試薬が被害を被ったため、予定していた実験の再スケジューリングを要した。当初予定していた、in vitroにおけるTGF-β-Hippo pathwayのクロストークに関する検討がまだ終了しておらずやや遅れていると判断する。

今後の研究の推進方策

YAP低発現株を用いてプラスミドによるYAP強制発現系とYAP高発現株を用いたsiRNAによる発現抑制系を作成する→細胞内Smadシグナルの変化や細胞増殖能や浸潤能へ与える影響をMTT assayやinvasion assayを用いてcontrolと比較検討する。TAZに関しても同様に検討を行う。具多的な方法としては、・YAP/TAZの膵癌細胞株への強制発現の方法は、YAP/TAZのcDNAをサブクローニングした後に、GATEWAYシステム（invitrogen）を用いて発現ベクターを作成する。申請者らはこれまでの研究においてすでにベクターを作成し保有しており、作成したプラスミドは、大腸菌へ導入し、増幅させる。プラスミドを抽出・精製を行った後に、Lipofectamineを用いて、細胞へ導入する。発現抑制系では、YAP/TAZ高発現株へYAP/TAZのsiRNA（invitrogen）を行い、細胞内Smadシグナルの低下を確認する。細胞増殖能の変化や浸潤能の変化などの表現型が得られた場合には、YAP/TAZならびにSmadの標的遺伝子を同定するために、cell-cycle-related genesやEMT-related genesの発現変化をcontrol群と比較検討する。

次年度使用額が生じた理由

試薬、消耗品の購入費、及び、研究データの管理、資料整理を行ってもらうための事務補佐員の雇用経費に充てたい。

研究成果

• [学会発表] 腫瘍微小環境における炎症性シグナルを介した膵癌進展メカニズムの解明 (2018)
  • 著者名/発表者名: 有馬浩太、伊東山瑠美、石本崇胤、三宅慧輔、内原智幸、中川茂樹、岡部弘尚、林洋光、今井克憲、近本亮、山下洋市、馬場秀夫
  • 学会等名: 第29回日本消化器癌発生学会総会