| 研究課題/領域番号 |
18K08709
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
増田 稔郎 熊本大学, 医学部附属病院, 非常勤診療医師 (50551256)
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| 研究分担者 |
山下 洋市 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 准教授 (00404070)
岡部 弘尚 熊本大学, 医学部附属病院, 助教 (40573621)
今井 克憲 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (60555746)
中川 茂樹 熊本大学, 医学部附属病院, 特任助教 (10594872)
日比 泰造 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (10338072)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 肝内胆管癌 / CXCL12 / cDNAマイクロアレイ / 転移 / Vivo |
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| 研究実績の概要 |
肝内胆管癌 (ICC)は原発性肝癌の約5-10%を占めており、根治的切除後も高率に再発をきたす予後不良な癌の一である。本研究はICCにおける転移・再発のメカニズムを解明し、転移・再発における新規治療ターゲットを見出すことを目的とした。本研究は、九州肝臓外科研究会の共同研究として、多施設からICCの原発巣及び転移巣の凍結標本2症例、薄切標本19症例のサンプルを集めた。そのうち凍結標本2症例の原発巣及び転移巣をcDNAマイクロアレイに提出し、原発巣に比べ転移巣で高発現及び低発現する複数の遺伝子群を同定した。それらの中から、転移巣で高発現していたCXCL12をターゲットとし、計30症例の薄切標本の免疫化学染色で評価した結果、CXCL12が原発巣に比べ肝転移巣で有意に高発現していた。本研究では、in vitro及びin vivoにおいて、CXCL12の抑制やその受容体であるCXCR4あるいはCXCR7の阻害により、ICCの肝転移・再発が抑制されるかについて検討する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の研究計画は、in vitroにおけるCXCL12抑制によるICCの転移抑制効果を検討することである。我々はヒト胆管株SSP-25、HuH-28に２種類のsiRNA (#1及び#2)をtransfectionし、CXCL12抑制を行った。以下、Transfection後48時間の株を用いて研究を行った。
(1)浸潤能の検証：常温に戻したCorning® BioCoatTM マトリゲルインベージョンチャンバーを細胞株の培養液で中和した後、SSP-25を2000個、HuH-28を3000個インサート内にそれぞれセットした（各細胞株 n=3）。CO2インキュベーターで48時間保温した後、インサートを回収した。インサートのメンブレンを固定・乾燥させ、顕微鏡100倍率で3視野の細胞数を目視にてcountした。両細胞株共に、control群に比べてCXCL12抑制株において有意に浸潤細胞の現象を認めた（SSP-25; p<0.0001, HuH-28; p<0.0001）。
(2)遊走能の検証：siRNAをtransfectionしたSSP-25及びHuH-28株をそれぞれ6 wellにまき、オールインワン顕微鏡 (KEYENCE, Osaka, Japan)を用いて5分毎24時間、細胞の遊走を観察した。両細胞株それぞれ20個の細胞の遊走状況をtime-lapse tracking system (KEYENCE, Osaka, Japan)を用いて計測、評価した。両細胞株共に、control群に比べてCXCL12抑制株において有意に遊走距離の抑制を認めた（SSP-25; p<0.0001, HuH-28; p<0.0001）。
H30年度の研究結果により、in vitroにおいて、CXCL12抑制によるICCの浸潤能及び遊走能抑制効果を確認できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
CXCL12を抑制したICC細胞株の生体内の動向を、免疫不全マウスを用いて検証する。具体的には、CXCL12のヒトshRNAを組み込んだレンチウイルス粒子をSSP-25及びHuH-28にtransfectionし、CXCL12を低発現するICC安定株を作成する。作成した安定株を、免疫不全マウスの尾静脈から投与する肺転移モデルと脾臓に直接投与する肝転移モデルを用いて、細胞株接種後4～6週後の各臓器におけるICC株の転移巣形成能をcontrolと比較し評価する。
これらの研究により、生体内におけるCXCL12と転移巣形成能及び臓器特異的転移形成能との関連を評価する。得られた結果を踏まえ、CXCL12の受容体であるCXCR4あるいはCXCR7の阻害剤投与により、in vitroにおいてCXCR4/CXCR7-CXCL12相互作用の抑制による転移抑制効果を検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
試薬、消耗品等については、医局保管のものを使用することが出来た。
研究費は主に試薬などの消耗品購入費に充てるほか、情報収集や研究成果発表にかかる学会出張旅費に充てたいと考える。
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