| 研究課題/領域番号 |
18K08835
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| 研究機関 | 愛知医科大学 |
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研究代表者 |
藤田 義人 愛知医科大学, 医学部, 教授 (90238593)
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| 研究分担者 |
浅井 清文 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (70212462)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 脳浮腫 / アクアポリン / ノックダウン / AQP4 |
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| 研究実績の概要 |
研究の基礎とるアクアポリン（AQP）Knockdownとover-expression細胞株の確立と並行して低酸素負荷でのカテコラミンサージのレスキューとして期待している薬物βブロッカーの効果発現の実験を行なった。
RNA interferenceによるknockdownが確認されている配列をもとにvectorを作成した。Transfectionは、Lipofectamineおよびリポフェクション(Trans-IT Neural)を使用した。Transfection効率をリアルタイムPCR、およびウエスタンブロッテングにて確認した。おおかたAQP4の発現を２割程度に抑えていることを確認できた。一応の確立をみたと考えている。AQP4のoverexpression細胞株の確率のため、hAQP4-M23およびhAQP4-M1を発現するラット星状膠細胞であるC6を作成した。可視化のためVenusを挿入したpCAGIPuro-hAQP4-Venus vectorをM1 およびM23 それぞれ作成し,ラット星状膠細胞であるC6に、Lipofectamineを用いて、transfectionした。蛍光顕微鏡及び、ウエスタンブロッティングにて蛋白発現を確認した。こちらも一応の確立をみたと考えている。
低酸素負荷は、負荷後に細胞が増える傾向を認めたため原因の追究している。低酸素負荷は、負荷後に細胞が増える傾向を認め、不安定な状況である。そのため原因の追究を行なっている。現在での低酸素負荷が、プレコンディショニングの状態を惹起し、細胞死を確かめる実験の操作での少量酸素が細胞増加の原因の一つと考えている。
並行して行なった低酸素負荷で起こるカテコラミンサージとβブロッカーの実験は、βブロッカーがTNF-αのmRNA発現量に及ぼすエピネフリンの効果に拮抗することを見出している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ノックダウンとover-expressionの確立している。しかし、低酸素負荷は、負荷後に細胞が増える傾向を認め、不安定な状況である。そのため原因の追究を行なっている。現在での低酸素負荷が、プレコンディショニングの状態を惹起し、細胞死を確かめる実験の操作での少量酸素が細胞増加の原因の一つと考えている。繰り返し確かめられた現象であるので、解決策として実験工程を全て低酸素で行える低酸素専用のインキュベータの購入を検討している。そのため本年度の研究費を次年度に残し合算して購入を検討する。
低酸素の影響、低温の影響などの実験の方をさらにすすめていく必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、実際の低酸素における脳浮腫効果の解明を始めている。低酸素状態の程度によってアポトーシスを起こしている現況を定量的調節できることを目指したい。低酸素での影響を評価できるよう、研究を進めている。それらを行った上で、ノックダウン、over-expressionをもちいてアポトーシスに対しての影響を検討する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
理由 アストロサイトの調達を現時点では、毎回ratをsacrificeしてのprimary cultureでではなく、業者からの購入した細胞を使用した。そのため、若干の経費の繰越となった。現在、我々の行なっている低酸素負荷条件では、負荷後に細胞が増える傾向を認め、不安定な状況である。そのため原因の追究を行なっている。現在での低酸素負荷が、プレコンディショニングの状態を惹起し、細胞死を確かめる実験の操作での少量酸素が細胞増加の原因の一つと考えている。繰り返し確かめられた現象であるので、解決策として実験工程を全て低酸素で行える低酸素専用のインキュベータの購入等を検討している。計画に則り使用する予定である。
使用計画 計画に則り使用する予定である。早期に、低酸素、低温の条件の確立を目指す。これらの成果を学会等で発表する予定である。
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