| 研究課題/領域番号 |
18K08895
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| 研究機関 | 福島県立医科大学 |
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研究代表者 |
関亦 正幸 福島県立医科大学, 医学部, 准教授 (80250190)
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| 研究分担者 |
関亦 明子 山形大学, 医学部, 准教授 (50321823)
伊関 憲 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (70332921)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 炎症 / サイトカイン / サイレンサー / 転写制御 / インターロイキン９ / 非コードRNA / lncRNA |
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| 研究実績の概要 |
敗血症などの全身性炎症反応症候群は、過剰なサイトカイン産生で重症化する致死性の高い疾患である。しかし、どのような機構で免疫系が過剰な反応を示し、大量のサイトカインを一気に放出するのか詳細についてはよく分かっていない。そのため有効な治療法が確立していないのが現状である。本研究では、サイトカイン産生を適正に保つために、タンパク質の遺伝情報を持たない長鎖非コードRNA（lncRNA：long noncoding RNA）に着目し、このlncRNAによる遺伝子発現調節機能を利用した新たな炎症制御法の創成を目指している。そこで、気管支喘息重症化の原因サイトカインであるインターロイキン９（IL-9）に着目する。申請者らはこれまでの研究で、IL-9遺伝子の下流6 kbの非コードDNA領域にサイレンサーを同定し、このサイレンサーはIL-9遺伝子プロモーターに作用して転写を抑制できることを見出した。しかも、このサイレンサーからは、タンパク質情報をコードしないlncRNAが転写されていることを世界に先駆け突き止めた。IL-9サイレンサーの持つ転写抑制機能を、このlncRNAが担っている可能性がある。そこで本研究では、IL-9遺伝子座から転写されるlncRNA の実体解明を進めることで、lncRNAによるIL-9遺伝子発現調節機能を利用した新たな炎症制御法の創成を推進する。まず、ゲノムDNA上のどの領域からlncRNA が転写されるのか正確な転写開始点と転写終結点を決定する。更に、このlncRNAに結合するタンパク質を網羅的に同定し、lncRNA複合体によるIL-9転写抑制のメカニズムを解明する。次いで、lncRNA複合体の機能を制御する低分子化合物をライブラリーから選別し、得られる化合物を活用した新たな炎症制御法の創成を目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
サイトカイン産生するヘルパー免疫Th細胞は、様々なサブセットに分化し特異的なサイトカインを産生することでその機能を発揮している。例えば、タイプ１ヘルパー免疫細胞（Th1）は、サイトカインとしてインターフェロンガンマ（IFN-g）を産生することでマクロファージや好中球を活性化して細胞性免疫反応に関与している。また、タイプ２細胞（Th2）は、インターロイキン４（IL-4）を産生することでB細胞を活性化して抗体反応を調節することで液性免疫に関与している。また、最近同定されたタイプ９細胞（Th9）の詳細な機能については不明な点が多いが、IL-9を産生することで気管支喘息の重篤化に関わることが知られている。これらのThサブセットは、特異的に産生するサイトカインで他のサブセットへの分化を抑制していることから、IL-9の転写量を、各サブセットを用いたRT-PCR法で解析したところ、Th1細胞において強いIL-9の転写抑制が認められた。おそらく、この転写抑制されているTh1細胞において、IL-9サイレンサーが機能していると推測された。そこで、この領域のDNAメチル化状態をバイサルファイト法を用いて決定したところ、想定通り、Th1細胞において高度に脱メチル化されておりクロマチン構造がエピジェネティカルにオープンな構造をしていることが判明した。一方、Th9細胞において、この領域は高度にDNAメチル化されており、サイレンサー機能が抑制されていることが判明した。以上の解析から、IL-9サイレンサーはIL-9遺伝子の転写が抑制されているTh1細胞において機能していることが明らかになった。現在は、このサイレンサー領域から転写されるlncRNAの転写開始点と終結点をRACE法を用いて解析しており、lncRNAの実態解明に向けた研究を推進していることから、おおむね予定通りに研究は進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
IL-9サイレンサーから転写されるlncRNAの転写開始点と終結点を5’RACEと3’RACE法を用いて決定することでlncRNAの実体解明を進める。これにより、IL-9サイレンサー内に存在すると思われるIL-9サイレンサー特異的なプロモーターを決定する。この同定したプロモーターを組み込んだルシフェラーゼ活性をレポーターとして用いる転写活性測定用のレポーターベクターに組み込んで、各Thサブセット細胞を用いたトランスフェクション測定を行うことで、どの領域に転写活性開始点であるプロモーター活性化あるか決定する。lncRNAの実体解明が進んだところで、本lncRNAを過剰発現させた細胞株や、逆にsiRNAによってlncRNAをノックダウンさせることで機能阻害した細胞株を用いて、本lncRNAの生理機能を詳細に解析する。また、本lncRNAをゲノム編集法で欠損したマウスを作成することで、lncRNAのマウス個体での機能を解明する。本研究の進捗状況を踏まえ、更に、本lncRNAを過剰発現した細胞株を用いて、
lncRNAの活性を増強、または、抑制する低分子化合物のケミカルライブラリーからのスクリーニングを進める。これにより、得られる化合物を活用した新たな炎症制御法の創成を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
一つの試薬を購入できるほどの金額ではなかったために、すなわち少額であったために次年度に繰り越して使用しようと考えたため。
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