| 研究課題/領域番号 |
18K08972
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
堀江 信貴 長崎大学, 病院(医学系), 講師 (70380912)
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| 研究分担者 |
日宇 健 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 客員研究員 (00404260)
定方 英作 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 研究協力員 (10772139)
西田 教行 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 教授 (40333520)
出雲 剛 長崎大学, 病院(医学系), 講師 (40343347)
諸藤 陽一 長崎大学, 病院(医学系), 助教 (40437869)
佐藤 克也 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(保健学科), 教授 (70398147)
山口 将 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 客員研究員 (70712131)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 脳梗塞 / 神経幹細胞 / 移植 |
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| 研究実績の概要 |
Sparague-Dawleyラットを使用し、ナイロン糸を中大脳動脈分岐部まで挿入し、左内頸動脈遮断下に血管閉塞を行った。腹側頸部正中切開し、総頸動脈、外頸動脈、内頸動脈を露出させ、総頸動脈より 4-0ナイロン糸を用い閉塞とした。梗塞24時間後にヒト骨髄由来間葉系細胞(human mesenchymal stem cell :hMSC)を経動脈的に移植した。イソフルレン吸入麻酔下、頸部皮下を正中切開し、頚動脈あるいは頚静脈を露出し、頚動脈的投与はポリエチレンカテーテルを用いて同側頚動脈より緩徐に注入した。投与細胞数は1×1000,000個、PBS投与の2群に振り分けた。評価項目として、modified neurological severity score (mNSS), cylinder testによる行動学的評価、cresyl violet染色による梗塞size評価、更に免疫組織染色を行い同側、及び対側の遊走神経幹細胞を定量を行った。
対側subventricular areaの内在性神経幹細胞（Musashi-1陽性細胞）を脳梗塞後day 2, 3, 7,14日のサンプルで定量すると、day 3において細胞移植群がコントロール群と比べ有意に多く発現していた(10.0% vs. 4.7%)。一方で、脳梁Corpus callosum ではday 7において細胞移植群がコントロール群と比べ有意に多く発現していた(292 cells/mm2 vs. 67.5 cells/mm2)。
一方で、細胞移植群は脳梗塞後の体重減少がコントロール群と比較して有意に改善しており、神経学的評価mNSSでは有意差はないものの、改善傾向であった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
脳梗塞モデルについてはTTC染色にて均一の大きさを持つ脳梗塞の確立が達成された。しかしながら移植細胞の効果による影響を見るために移植細胞を標識する染色がうまくいかない。移植細胞自体の生存率が低い可能性がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
移植幹細胞のソースを変更する。若年由来のヒト脂肪幹細胞が入手できるため、これまで確立した脳梗塞モデルに対して、ヒト間葉系幹細胞で行った経動脈投与と同世の手法で、ヒト脂肪幹細胞の投与を行う。その後、ヒト細胞核マーカーにて蛍光免疫染色、DAB染色を行い、長期的な移植細胞の生存率を確認する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成30年度に行う予定だった対側大脳半球におけるの栄養因子活性の網羅的検索について、蛍光免疫染色による移植細胞の同定が困難であったため、栄養因子の同定には至らなかった。
使用計画として、移植細胞の生存率を評価することが先決であると考えられたため、組織評価およびプロテインアッセイの予定とした。移植細胞ソースとしてヒト脂肪幹細胞の使用を計画しているため、令和元年度は、ヒト脂肪幹細胞及び、ヒト幹細胞マーカー（試薬）、及び組織染色とプロテインアッセイの試薬を購入予定である。
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