| 研究実績の概要 |
染色体のテロメア伸長をもたらす逆転写酵素遺伝子であるTERT（Teromerase reverse transcriptase）遺伝子のプロモーター領域の点突然変異（C228TかC250T）が成人膠芽腫の55～83％、乏突起膠腫の70％以上の頻度で検出され,診断上重要な分子マーカーである。TERTプロモーター領域はGC含量が高いうえに繰り返し配列を含むため、変異検出のための通常のDNAシークエンス法では感度や再現性が低く偽陰性が多い。そこで、我々は短時間かつ高感度に再現良くTERT遺伝子変異を解析すべく独自に最適化した Droplet Digital PCR（ddPCR）法の確立を試みた。グリオーマの凍結組織及びパラフィン包埋後の組織由来のDNA 10ngに対して、それぞれ別々の蛍光色素でラベルした TERT変異型と野生型プローブの存在下で最適化したddPCR増幅を行い、変異型と野生型のDNAのコピー数を定量した。その結果、凍結組織及びパラフィン包埋固定後の組織由来DNAに対して、TERT変異型（C228T,C250T）とTERT野生型のアレルのコピー数が競合することなく、1回のddPCRにて定量的に検出された。ddPCR法はサンプル内にPCR増幅される遺伝子があれば必ず増幅検出されるため、0.1％の変異DNAでも検出が可能な高感度な遺伝子変異検出法であり再現性も極めて高い。特に変異のホットスポットが判明している遺伝子解析に対しては有用な方法である。極めて微量のDNAでも解析可能で、血漿や髄液を用いたcirculating DNA からの遺伝子変異検索の可能性へも繋がる画期的な手法である。本法の確立により上記課題の目的は達成された。
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