| 研究課題/領域番号 |
18K09026
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
石井 久雄 名古屋大学, 医学系研究科, 寄附講座助教 (30738349)
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| 研究分担者 |
栗本 秀 名古屋大学, 医学系研究科, 特任講師 (70597856)
平田 仁 名古屋大学, 予防早期医療創成センター(医), 教授 (80173243)
大河原 美静 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (80589606)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | サルコペニア / 神経筋接合部 |
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| 研究実績の概要 |
まず先行研究で行ったATF2－Luciferase reporter vectorを用いたLuciferase assayにて、Agrin-LRP4-MuSKシグナリングの促進効果を認めた40種類の薬剤を用いて１次スクリーニング試験を行った。マウス筋芽細胞株C2C12を培養し筋管へ誘導した後、neural agrin (10ng/ml)存在下で各薬剤を10μMの濃度で添加し、α-Bungarotoxin Alexa Fluor 594 conjugateにてアセチルコリンレセプターの蛍光免疫染色を行い、画像解析ソフトMetaMorphにてアセチルコリンレセプター凝集の数、面積、信号強度の総和をそれぞれ筋管の総面積で割った値を算出した。この1次スクリーニング試験によって、筋管におけるアセチルコリンレセプターの凝集促進作用を示した上位６剤を２次候補薬とした。
現在、この２次候補薬６剤を用いて、順次下記の２次スクリーニング試験を行っている。
２次スクリーニング試験では、C2C12細胞を培養し筋管を形成した後、neural agrinとともに１次スクリーニングで得られた候補薬を添加し、抗MuSK抗体を用いた免疫沈降後、Western blottingを行い、抗リン酸化tyrosine抗体を用いてリン酸化MuSKの発現量を、投与後30分、1時間、3時間、6時間、24時間の5段階で定量評価している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
初年度（平成30年度）中に1次、2次スクリーニングを終了し、平成31年度から動物実験を開始する予定であったが、1次スクリーニングで得られた候補薬のそれぞれにつき濃度差試験、反応時間差試験等を行っており、初年度中に2次スクリーニングを完了することができず、当初の計画よりも若干の遅延を認めるため。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在行っている2次スクリーニングを完了し、得られた候補薬を用いて予定している高齢モデルマウスを用いた動物実験を行う予定である。動物実験では、24月齢C57BL/6マウスまたは老化促進マウス（SAM）を用いて、候補薬剤およびプラセボを経口ゾンデもしくは腹腔内注射にて投与し、運動機能解析、筋の画像解析、電気生理学的検査、組織学的評価、mRNA・蛋白解析等を行うことを計画している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
初年度に2次スクリーニングまで終了予定であったが、スケジュールに若干の遅延を生じており現在2次スクリーニングを行っている途中であり、初年度に購入予定であった免疫染色試薬や各種抗体の未購入分の予算が、次年度使用となった。
今後、計画通り実験を進めるにあたり、順次初年度未購入分の各種試薬を購入し、予算を使用する予定である。
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