| 研究課題/領域番号 |
18K09027
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| 研究機関 | 滋賀医科大学 |
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研究代表者 |
彌山 峰史 滋賀医科大学, 医学部, 講師 (60362042)
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| 研究分担者 |
森 幹士 滋賀医科大学, 医学部, 准教授 (30467386)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 後縦靱帯骨化 / 黄色靱帯骨化 / 内軟骨性骨化 / マイクロRNA / プロテオミクス |
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| 研究実績の概要 |
脊柱靱帯（後縦靱帯: OPLL、黄色靱帯: OLF）骨化症は進行性かつ重篤な脊髄症状を生じうる疾患であるが、現在有効な治療法は神経症状を緩和・改善させる投薬、四肢機能の維持を目的としたリハビリテーション、脊髄の圧迫を除去する外科的治療に限られており、骨化の進行を抑制する治療は未だ確立されていない。本研究の目的はプロテオミクスによる疾患関連タンパク質の網羅的解析を行い、新しい“骨化抑制療法”の開発に向けた新しい知見を得ることである。
これまで我々は、骨化巣形成に重要である骨化前線の内軟骨性骨化に関する研究を行い、OPLL/OLFでは骨化前線部においてRunx signaling、Wnt signaling、Indian hedgehog signalingなどの軟骨細胞分化、骨芽細胞分化を誘導・促進するシグナルのmRNA発現が亢進し、さらに外的負荷を加えるとこれらの発現量は有意に上昇することを明らかにできた（Spine, Arthritis Res Ther）。また、これらのmRNAの発現を抑制的に制御すると考えられるmicroRNAの網羅的解析を行った結果、OPLLに特異的なmicroRNAとしてhsa-miR-483b-3p/down regulationの存在、およびその標的因子の骨化前線における発現と局在について報告することができた（J Orthop Sci）。
microRNAの発現パターン変化についての解析を進め、また現在行っているプロテオミクス解析を相関させることで、ゲノミクス、プロテオミクスを組み合わせた観点からみたOPLL/OLF疾患関連因子について研究を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
遺伝子発現は特定の生物に均一であるのに対し、実際のタンパク質発現は同一生物でも細胞組織、時間経過、細胞外環境によって発現が変化することが特徴であり、その原因として選択的スプライシング、タンパク修飾などが挙げられている。したがって、ゲノミクス、プロテオミクス解析を組み合わせることで、OPLL/OLFに特異的な遺伝子発現という“共通性”と、それに対する骨化形態の“多様性”について検討している。
現在、連続型OPLL、分節型OPLL、頚椎症性脊髄症（比較対照）のそれぞれの症例から得た培養細胞に対するプロテオミクス解析を中心に研究を進めている。各群より代表的な4症例を抽出し、iTRAQによるタンパク質定量解析、LC-MS/MS解析によるタンパク質同定を行った結果では、発現がみられた総蛋白数は4353種となった。連続型OPLL群と頚椎症性脊髄症群の比較では、連続型OPLL群にて発現が上昇したタンパク質は2113種、ほぼ同量であったものが12種、発現が低下していたものが2228種であった。さらに発現量を2倍でcut lineとすると37種のタンパク質が抽出できた。先行実験であるmicroRNAの発現解析による結果に相関させると、これら37種のタンパク質を標的とし、かつOPLL群に有意に発現していたmicroRNAは6因子であった。今後、発現タンパク質のパターンから考えられるシグナル伝達解析など、さらなる検討を進める予定である。
以上の結果については、日本整形外科学会、日本脊椎脊髄病学会、日本リハビリテーション医学会などにて学会発表を行い、結果についての考察、討論を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
プロテオミクス解析に関しては、連続型OPLL群、分節型OPLL群、頚椎症性脊髄症群の3群についてそれぞれの解析を進め、OPLLの形成に関する因子、およびOPLLの骨化進展に関する因子について検討を進める予定である。
本年度の実験計画では、プロテオミクス解析を継続して進める予定である。有意な発現を認めたタンパク質に対しては、標的とするmicroRNAの発現解析および組織標本上での発現局在を観察する予定である。また、タンパク質に関連したサイトカイン発現に着目し、骨免疫の観点からOPLL/OLFに関与する骨芽細胞、軟骨細胞の分化に関する機構の解析を進める予定である。
今後、これらの結果についての十分な裏付けを行った後、学会発表、英文雑誌への投稿を計画している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度の研究ではプロテオミクス解析を中心に科研費を使用いたしました。その他の物品代として細胞培養関連試薬、免疫染色関連試薬を使用しましたが、これらの試薬、抗体の購入にかかる費用の一部を次年度使用額とさせていただきました。
次年度では免疫染色を多く実験予定としておりますので、次年度使用額が大きくなることが予想されます。
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