| 研究課題/領域番号 |
18K09027
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| 研究機関 | 滋賀医科大学 |
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研究代表者 |
彌山 峰史 滋賀医科大学, 医学部, 講師 (60362042)
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| 研究分担者 |
森 幹士 滋賀医科大学, 医学部, 准教授 (30467386)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 後縦靭帯骨化 / 黄色靭帯骨化 / 内軟骨性骨化 / マイクロRNA解析 / プロテオミクス |
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| 研究実績の概要 |
脊柱靱帯骨化症（後縦靱帯: OPLL、黄色靱帯: OLF）は進行性かつ重篤な脊髄症状を生じうる疾患であるが、現在有効な治療法は神経症状を緩和・改善させる投薬、四肢機能の維持を目的としたリハビリテーション、脊髄の圧迫を除去する外科的治療に限られており、骨化の進行を抑制する治療は未だ確立されていない。本研究の目的はプロテオミクスによる疾患関連タンパク質の網羅的解析を行い、新しい“骨化抑制療法”の開発に向けた新しい知見を得ることである。
病理組織学的には脊柱靱帯の骨化過程は内軟骨性骨化に準じており、骨化巣には近接して骨化前線が存在する。我々はこの骨化前線に着目して研究を行っており、骨化前線の細胞分化に関与する因子としてRunx signaling、Wnt signaling、Indian hedgehog signalingなどの軟骨細胞分化、骨芽細胞分化を誘導・促進するシグナルのmRNA発現が、脊柱靱帯骨化症において亢進していることを報告した（Spine 2012, Spine 2013）。
さらに上記のmRNAの発現調節に関与する因子の解析を目的としてmicroRNA array解析を行うと、OPLL由来の培養細胞においてhsa-miR-483b-3p/down regulationを有意に認めた。このことはhsa-miR-483b-3pの標的因子の1つであるWnt signaling伝達物質の発現亢進を示唆しており、Wnt signalingの異常発現による骨芽細胞分化促進がOPLLの病態に関与すると考えられた（J Orthop Sci 2018）。
これらの結果より、ゲノミクス、プロテオミクスを組み合わせた観点からみたOPLL/OLF疾患関連因子の解析、さらには新しい骨化抑制療法の開発に寄与する知見を得るべく研究を継続している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
遺伝子発現は特定の生物に均一であるのに対し、実際のタンパク質発現は同一生物でも細胞組織、時間経過、細胞外環境によって発現が変化することが特徴であり、その原因として選択的スプライシング、タンパク修飾などが挙げられている。したがって、ゲノミクス、プロテオミクスを組み合わせることで、OPLL/OLFに特異的な遺伝子発現という“共通性”と、それに対する骨化形態の“多様性”について観察が可能と考えられる。
プロテオミクス解析として、連続型OPLL、分節型OPLL、頚椎症性脊髄症（CSM; 比較対照）の各群から代表的な4症例の靱帯組織由来培養細胞に対して、iTRAQによるタンパク質定量解析、LC-MS/MS解析によるタンパク質同定を行った結果、発現した総蛋白数は4353種であった。Cut lineをabundance ratio＞2とすると、CSM群に対して連続群では37種、分節群では18種のタンパク質が抽出できた。さらに連続群と分節群に共通してCSM群より高値となった13種をpick-upし、これらタンパク種よりシグナル解析を行うと細胞のグリコシル化に関与する因子が有意となった。同様に、OPLL群の中で連続群と分節群の比較を行うと76種のタンパク質が抽出でき、シグナル解析ではS-100タンパク質の関連因子が有意となった。現在はこのプロテオミクス解析の結果と、先行実験であるmicroRNA arrayとの相関性について解析を進めており、骨化過程のtriggerとなる因子、および骨化形態を規定する因子について検討している。
以上の結果については、日本整形外科学会、日本脊椎脊髄病学会、日本リハビリテーション医学会などにて学会発表を行い、結果についての考察、討論を継続している。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究の対象は、連続型OPLL群、分節型OPLL群、CSM群の3群であり、プロテオミクス、microRNA arrayから得られた結果からOPLLの形成に関する因子、およびOPLLの骨化形態に関する因子について検討することである。
骨化靭帯由来の培養細胞に対するmicroRNA arrayの結果から、OPLL群においてはhsa-miR-483b-3p/down regulationが最も有意な変化となっていた。このmicroRNAが標的とする遺伝子はdatabaseから14種が挙げられ、Wnt signalingを主とした骨芽細胞分化に関連するシグナル、転写因子となっていた。また、プロテオミクス解析ではCSM群に対して連続群では37種、分節群では18種のタンパク質が抽出できた。タンパク質の発現パターンからは、細胞のグリコシル化、S-100タンパク質関連因子が骨化に関与していることが示された。
今後の研究計画では、プロテオミクスの結果解析をさらに進め、先行実験であるmicroRNA arrayとの相関性を検討する予定である。Database解析に加え、標的因子の組織学的な発現局在を観察し、骨化に関与する細胞分化、骨芽細胞調整因子に着目して研究を進めている。これらの結果についての十分な裏付けを行った後、学会発表、英文雑誌への投稿を計画している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
プロテオミクス解析、細胞培養関連試薬、免疫染色関連試薬などに資金を使用しました。また、海外学会にて発表を行うにあたり旅費を使用しました。
今回発生した次年度使用額は、研究の継続に関連する試薬、抗体の購入に用いる予定です。
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