| 研究課題/領域番号 |
18K09065
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
長谷井 嬢 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (40636213)
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| 研究分担者 |
寺村 岳士 近畿大学, 医学部附属病院, 講師 (40460901)
村川 泰裕 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, チームリーダー (50765469)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | TWIST1 / エンハンサー / ゲノムワイド |
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| 研究実績の概要 |
不死化ヒト軟骨細胞株(TC28)においてTWIST1を強制発現させ、LC-MSでTWIST1と結合するタンパク質を網羅的に測定した。また、TC28にAd-TWIST1-IRES-GFPを用いてTWIST1を高発現させ、FACS ariaでGFP発現のある細胞だけをソートし、TWIST1高発現細胞株を集めてRNA抽出を行った。このサンプルを分担施設である理研-HMC臨床オミックス特別ユニットへ送付し、共同研究の形で、CAGE法によりゲノムワイドにエンハンサー領域の検出を行った。この結果は既にデータとして受け取っており、現在は近畿大学と共同でCAGEデータの解析と、インフォマティクス解析によりTWIST1関連エンハンサー領域候補の解析を行っている。また並行して、TC28にMycタグを付加したTWIST1を強制発現したサンプルを用いて、Myc抗体でクロマチンIPを行い、バリデーション作業を行っている。TC28細胞株へTWIST1だけでなく、複合体を作り得る別タンパクの共過剰発現を行い、抗タグタンパク質抗体を用いてクロマチンIPシークエンスを行う予定である。これにより複合体として結合し、直接制御される領域の確定を目指す。また、確認の為には、２つのguideRNAを用いてCRISPR-deletionにより特異的にエンハンサーの除去を行い、転写に変化が起きるか観察する事が必要であり、今後それらを行っていく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
最も重要であった、CAGE法によるゲノムワイド解析は終了しておりデーターベースは構築できている。今後は確認作業が中心となるため、予定通りの経過である。
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| 今後の研究の推進方策 |
ヒト軟骨細胞、TC28細胞株へTWIST1、TEX10をそれぞれあるいは共過剰発現を行い、抗タグタンパク質抗体を用いてChIPseqを行う。これにより複合体の結合で直接制御される領域を確定する。また、２つのguideRNAを用いたCRISPR-deletionによりエンハンサーの除去を行い転写への影響を観察する。ヒト正常, OA軟骨組織を用いてCAGE法によりエンハンサー変化を解析する。TWIST1過剰発現時のエンハンサー変化を比較する事で、OAへの関与も解析可能である。発展研究としてTWIST1低発現、高発現の骨肉腫細胞株を用いてCAGEを行い、異なる細胞種での機能の保存性を観察する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
端数としてわずかな次年度使用額が発生している。次年度は研究計画上も研究費割り当てが少なく、消耗品として使用予定である。
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