| 研究課題/領域番号 |
18K09089
|
|---|
| 研究機関 | 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター |
|---|
研究代表者 |
細山 徹 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター, 再生再建医学研究部, 室長 (20638803)
|
|---|
| 研究分担者 |
松井 康素 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター, ロコモフレイルセンター, 部長 (50501623)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | 骨格筋幹細胞 / 幹細胞老化 / スリーピングビューティーシステム / マウスiPS細胞 |
|---|
| 研究実績の概要 |
加齢に伴う骨格筋減弱症であるサルコペニアへの対策は、超高齢社会に突入した我が国において認知症に並ぶ重要な課題である。現在までのところサルコペニアの発症や増悪の分子メカニズムは明らかではないが、近年の基礎研究では、骨格筋の成長や再生に必須な骨格筋幹細胞の老化－幹細胞老化－がサルコペニアの発症・増悪の一要因となり得ることが示されている。しかしながら、この幹細胞老化がどのような機構で誘導されるのかは不明であり、その機構が明らかとなればサルコペニアの新たな予防法や治療法の開発に結び付くと期待される。本研究では、スリーピングビューティー（SB）システムを用いて、マウス骨格筋幹細胞ゲノムに無作為に変異を入れて幹細胞老化を誘導する手法により、骨格筋幹細胞老化誘導因子の同定を目指している。昨年度までに、骨格筋幹細胞特異的CreドライバーマウスとSBマウスとの交配により作出したPax7CreER:SB11マウスからiPS細胞を誘導することに成功しているが、iPS細胞からの骨格筋幹細胞の分化効率が低く、実験系としてとしては脆弱であると言わざるを得ない。そこで本年度は、Myf6陽性細胞で特異的にGFPを発現する新たなiPS細胞を作出し、先に樹立したPax7CreER:EGFP-iPS細胞と併用することで、まずは効率的な分化誘導法の確立を目指した。実際には、低分子化合物や細胞成長因子の添加方法の変更により、幹細胞誘導効率がある程度改善された。そこで改めて、Pax7CreERマウス・SB11・EGFPマウスを掛け合わせて作出した三元交配マウスから新たなiPS細胞を樹立し、筋幹細胞への分化後にタモキシフェンによる無作為変異挿入をPax7陽性の筋幹細胞にのみSBシステムを作動させ、新規の細胞老化誘導因子を試みた。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初計画を変更し、iPS細胞技術を応用してスリーピングビューティーシステムを発動することとしたが、マウスiPS細胞からの骨格筋幹細胞の現行の分化誘導方法の効率が低いという事実に直面した。そこでまずは、高い分化効率を有する新たなプロトコルの開発が急務となり、研究計画の遅れが生じた。この点については、新たに樹立したMyf6CreER:EGFP-iPS細胞とPax7CreER:EGFP-iPS細胞を併用し、比較的効率の良い方法を新たに確立することができた（本研究課題の主題とは異なるが、骨格筋特異的CreドライバーマウスからのiPS細胞の樹立およびその応用の事例は過去に報告が無く、新しい知見として学術論文に報告した）。本法を用いて、Pax7CreER:SB11:EGFP-iPS細胞から骨格筋幹細胞を分化誘導し、幹細胞期にタモキシフェンを添加することでPax7陽性の骨格筋幹細胞特異的にSBシステムを発動させてゲノム上に無作為変異を誘導することに直手した。同時に発現誘導されるEGFPを目印に骨格筋幹細胞を単細胞に分離し、細胞老化マーカーの発現を指標として老化誘導された骨格筋幹細胞の選抜を行っている。現在までのところ、無作為変異誘導によって幹細胞老化が誘導された細胞は認められていないが、次年度中の同定を目指す。
|
| 今後の研究の推進方策 |
当初計画していたin vivoイメージング解析の代替え案として採用したiPS細胞技術を用いた方法について、分化誘導効率の向上なども含めて昨年度までにほぼ確立することが出来た。したがって本年度は、本in vitro系を用いて骨格筋幹細胞の老化誘導因子を同定する。SBシステムはランダムにゲノム上に変異をいれる方法であり、同定までには相当数の骨格筋幹細胞が必要になると予想されるが、iPS細胞技術を応用したin vitro系を採用したことにより、理論上は無限に骨格筋幹細胞を準備することができ、老化細胞誘導とその因子の効率的なスクリーニングが期待される。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
実験系の確立およびSBシステムによるゲノム変異挿入後の表現型解析に時間を有し、本年度に予定していた変異遺伝子の特定に係る解析（外注）を行うことが出来なかった。そのため次年度使用額が発生した。しかし上記問題点は、本年度内に一応の解決を見たため、次年度には確実な網羅的解析の実施が見込まれ、繰越金も含めて適切に執行できる。
|
