| 研究実績の概要 |
現在CRISPR/Cas9のシステムを用いてNfatc1のshortアイソフォーム特異的ノックアウトマウスを作成中である。合成したcrRNA (crRNA-T3, crRNA-T5 各8.7 ng/μl) , tracrRNA (14.3 ng/μl) , Cas9タンパク質(30 ng/μl) を用いRNP (Ribonucleoprotein) 複合体を形成させた。このRNP複合体とオリゴDNA (single-stranded oligodeoxynucleotides, 以下ssODNs, Nfatc1-ssODNs) 10 ng/μl を調製し、1～2 plを前核期受精卵(C57BL/6N系統) 計255個にインジェクションした。RNP複合体およびssODNs注入卵のうち、状態が良好な246個を受容雌マウスに移植した。受容雌マウスから生まれた親世代(F0) 産子を離乳まで飼育した。
体組織を採取し、ダイレクトシークエンスにより変異を確認した。目的の終止コドンを含む9塩基の挿入を認めた個体を得た。また、3個体(F0-1, F0-3, F0-5) では塩基の欠失、挿入が認められた。目的の終止コドンを含むF0マウスと野生型のマウスとの交配によりヘテロのノックアウトマウスを得た。ヘテロマウスには明らかな表現型はなかった。現在ヘテロノックアウトマウス同士を交配し、ホモノックアウトマウスを得ることを試みている。
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