2018 年度実施状況報告書

Transgenic spermを用いた卵活性化因子PLCζの機能解析

研究課題

研究課題/領域番号	18K09144
研究機関	名古屋市立大学
研究代表者	窪田裕樹名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 研究員 (10347403)
研究分担者	安井孝周名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (40326153) 梅本幸裕名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (80381812) 岩月正一郎名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 研究員 (70595397) 野崎哲史名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 臨床研究医 (50813432)
研究期間 (年度)	2018-04-01 – 2021-03-31
キーワード	精巣内遺伝子導入 / PLC zeta
研究実績の概要	PLCζ遺伝子を単離するべく、マウス精巣のcDNAライブラリーから既知のプライマーを用いて、全長(2.2Kb)にわたりPCR法により増幅させた。得られたPCR産物をゲル電気泳動により単離したのち精製したものを、TOPOベクターにサブクローニングしておいた。全長にわたりシーケンスを解析して全塩基配列がPLCζ遺伝子として正しいことを確認した。このPLCζ遺伝子を制限酵素で切り出して、GFPまたはYFP遺伝子を含むベクターに融合蛋白を発現するようにサブクローニングした。さらにPLCζ遺伝子+GFPまたはPLCζ遺伝子+YFPを制限酵素で切り出して、サイトメガロウィルスのエンハンサーとchickenのβ-actin プロモーターを含むpCAGベクターに組み込んで、融合蛋白の発現ベクターを作成した。また、コントロールとしてGFPまたはYFP遺伝子のみを発現するベクターも作成しておいた。融合蛋白の解析を行うために、HEK293細胞に燐酸カルシウムを用いて前述の融合蛋白発現ベクターを遺伝子導入した。融合蛋白を正しく発現することを確かめるために、48時間の培養の後にHEK293細胞から淡白を抽出した。ウェスタンブロット法により合成された蛋白が、予想される分子量と一致することを確認した。 In vivoで融合蛋白発現ベクターの遺伝子導入を行うには、大量のベクターが必要であるため、上記で作成したベクターを、TOP10細胞をcompetent cellとして十分な量が得られるまで増幅しておいた。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由 PLCζ遺伝子の全長にわたるクローニングおよび正しく融合蛋白を発現するベクターの作成に難渋したため。また、大量のベクターを作成する必要があり、ベクターの増幅にも時間がかかった。
今後の研究の推進方策	若干の遅れはあるが、概ね想定の範囲内で進行している。今後は予定通り、in vivoでの遺伝子導入を行い、transgenic spermを作成する。効率良くtransgenic spermを作成するための条件設定については十分な検討が必要である。
次年度使用額が生じた理由	年度末までの計画が早期に終了し、また次のステップの研究にかかる試薬の挿入が年度を超えたので、次年度使用額が生じた。引き続き計画に沿ってTransgenic spermを用いた卵活性化因子PLCζの機能解析を進めていく