| 研究課題/領域番号 |
18K09169
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| 研究機関 | 高知大学 |
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研究代表者 |
辛島 尚 高知大学, 教育研究部医療学系臨床医学部門, 准教授 (60304672)
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| 研究分担者 |
執印 太郎 高知大学, 医学部附属病院, 特任教授 (70128601)
津田 雅之 高知大学, 教育研究部医療学系基礎医学部門, 准教授 (90406182)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | VHL / CRISPR/Cas9 / セカンド/サードヒット遺伝子 |
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| 研究実績の概要 |
【研究目的】フォン・ヒッペル・リンドウ（VHL）病はVHLがん抑制遺伝子変異を原因とし、複数の臓器に腫瘍が多発する常染色体優性の遺伝性疾患である。これまでのVHLノックアウト（KO）マウスではヒトと同様の腫瘍形成は認められない。我々は、腫瘍の発生にはVHL遺伝子変異に続き、他の遺伝子の二次ないし三次変異（セカンド/サードヒット）が必要という仮説を立てた。本研究ではこれを証明するために、より能動的なゲノム編集技術CRISPR/Cas9を用いてVHL遺伝子変異に続くセカンド/サードヒット遺伝子変異の探索を行い、腫瘍形成能を有するVHL疾病モデルマウスの製作を目的とする。
【研究実績】VHL遺伝子変異はVHL病遺伝子診断に基づき、Tyr98HisとArg167Trpを用いた。Tyr98HisのヘテロノックインF1マウス同士での自然交配において産仔にホモマウスは認められず、Arg167Trpでも同様であった。Tyr98Hisの胎生期の解剖を連日実施し、肉眼的および病理組織学的観察を行った。7.5Eにおいて、胎盤は形成するも、胎嚢内に胎児が存在しない個体が散見された。文献的には、VHL-/-における10.5-12.5Eでの胎生致死が報告されているが、本研究では胎児形成は行われず、胎盤形成のみが進み、12.5-14.5Eで胎盤壊死が起こることが観察された。胎児を認めない個体では、多くの胎嚢内に胎児は見られず、VHL-/-では浸透率に偏りがあることが示唆された。
VHL遺伝子変異に続くセカンド/サードヒット遺伝子変異の探索を行うため、候補遺伝子のひとつであるPbrm1-KOマウスをCRISPR-Cas9を用いて作製し、Pbrm1-KOヘテロノックインF1マウスを得た。現在、Tyr98HisのヘテロノックインF1マウスとPbrm1-KOヘテロノックインF1マウスの自然交配を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
VHL遺伝子変異のTyr98HisホモマウスとArg167Trpホモマウスは胎生致死であった。VHLの一塩基置換変異体における胎生致死の過程は知られておらず、Tyr98Hisの胎生期の観察を詳しく行った。
次にVHL遺伝子変異に続くセカンド/サードヒット遺伝子変異として、候補遺伝子のひとつであるPbrm1のノックアウト（KO）をCRISPR-Cas9システムを用いて作製し、過程を得てPbrm1-KOヘテロノックインF1マウスを得た。Tyr98HisのヘテロノックインF1マウスとPbrm1-KOヘテロノックインF1マウスの自然交配を行っており、産仔のゲノムDNAをジェノタイピング解析する予定である。
以上の点から、進行状況はおおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
Tyr98HisのヘテロノックインF1マウスとPbrm1-KOヘテロノックインF1マウスの自然交配を行っており、産仔のゲノムDNAをジェノタイピング解析する予定である。両遺伝子変異を持つマウスが作製できれば、表現型を解析する。
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