| 研究課題/領域番号 |
18K09171
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| 研究機関 | 大分大学 |
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研究代表者 |
三股 浩光 大分大学, 医学部, 教授 (60219714)
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| 研究分担者 |
佐藤 吉泰 大分大学, 医学部, 医員 (00796302)
秦 聡孝 大分大学, 医学部, 准教授 (60404381)
山中 直行 大分大学, 医学部, 医員 (60796415)
安藤 忠助 大分大学, 医学部, 講師 (20433047)
平井 健一 大分大学, 医学部, 講師 (10404386)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 外尿道括約筋 / IL-6 / JAK-STAT |
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| 研究実績の概要 |
（方法）同意を得た膀胱全摘患者の外尿道括約筋を少量採取し、コラゲナーゼ処理して得た初代培養細胞をヒト筋細胞不死化法による遺伝子導入にて不死化する。不死化ヒト外尿道括約筋細胞を10cmdishに10^6個まき増殖用培地にて2日間培養後、一部の細胞から蛋白・RNA抽出を行い、JAK-STAT経路の因子に対してRT-qPCR行い定量分析を行う。残りの細胞は、分化培地に変えIL-6添加した分化誘導培地に変え、10日間培養し筋線維へ分化させる。分化後1、2、3、5、7日後の細胞から、蛋白抽出・RNA抽出を行い、各因子に対してRT-qPCR行い定量分析を行う。また、各因子かつ筋分化マーカーであるミオシン重鎖(MHC)の免疫染色を行い、各因子の局在変化や細胞の形態変化をみる。培地は2日毎に交換する。また、増殖培地でもIL-6を添加し増殖能の変化をみる。
（結果）Myogeninは分化培地に変更して2日後、MHCは3日後より発現を認め、5日後には筋管細胞の形成を認めた。IL-6添加にて軽度myogenin、MHCの軽度増加を認めた。JAK-STATについて、STAT3はIL-6添加後、発現の増加を認めた。SOCS3は分化培地後に有意に減少したが、IL-6添加後は軽度発現の増加を認めた。
増殖培地ではIL-6を添加することで、2日後の細胞数は2倍に増加した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
遺伝子レベルではIL-6添加することで、JAK-STATは亢進し筋分化を促進している可能性がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
外尿道括約筋細胞の増殖期において、JAK-STAT経路の主要因子に対し、SiRNAをトランスフェクションし、Knoch downもしくはウイルスベクターによる過剰発現系を用いて操作を行った後、IL-6添加した分化誘導培地に変え、蛋白・RNA抽出を行い、Western blotting、RT-qPCR行い定量分析を行う。免疫染色も行い局在や形態変化を観察する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
3月に参加を予定していた学会への参加が出来なくなった為に次年度使用額が発生。今年度参加予定
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