研究課題
国内臨床検体の提供を受け、梅毒トレポネーマDNA陽性例群(2015~2018 年分)について型別決定を行い、それらのデータの蓄積を進めた。検体中DNA量がGE Health Scienceの「genomi-phi」による増幅に必要な初期量を超える、またはそれに近いものについて選定を行い、検体中のtotal DNAを増幅させた。増幅後のtotal DNA量が Agilent の「Sure Select Target Enrichment System」が必要とする 50ng in 2ulを超えるものにつき、指定されたプロトコルで梅毒トレポネーマgenome画分を選択精製して、次世代シーケンサーで各検体中のその全情報を得ることを目指した。最終的にサンプルを次世代シーケンサーで解析ができ、得られたデータがゲノムカバー率90%以上、重複度10以上のものを信頼度が十分なものと判断してSNP比較を行い、予備的にMinimum Spanning Treeを作成した。型別決定途上でまた決定したマクロライド耐性型/感受性型を含む分子型別分布と由来検体患者の性的指向との間に相関性が存在することに気づき、新しい知見として英文誌に論文発表を行なった。試薬コストの面に鑑み、ゲノム配列全情報が成功裏に得られるための検体、およびその由来DNAの条件を見出すことが、今後、第一義的に重要であることを認識した。
2: おおむね順調に進展している
概要の項で述べた方法によって、これまでに2015~2018年の国内臨床検体から最終的に49検体由来のDNAを次世代シーケンサーで解析し、同項で述べた基準で、そのうち22検体由来のものを信頼性が十分と判断し、SNP比較を行い、予備的にMinimum Spanning Treeを作成した。この過程で、信頼性の高いゲノムシーケンスデータを得るためには、従来の分子型別が全ての項目で成功していることが必要条件であるが十分条件ではないことを確認することができた。得られた予備的Minimum Spanning Treeから、全体に国内検体は東アジア諸国での分離株と比較的近いpositionを占めたが、東アジアを含め諸外国株と同一と認められるものは無かった。一方、解析した国内株中、同一と考えられる株の組み合わせが見出され、上記、外国株と同一のものが無かったことと合わせて、このゲノム比較方法論は、株間相同性が極めて高く分類が困難と考えられてきた梅毒トレポネーマの感染ルート特定にも極めて有用であるという予備的結果を得ることができた。また、このSNP比較によるMinimum Spanning Treeでも、従来の分子型別でも、国内株は男性同性愛患者由来のものは様々な分子型がみられ、heterogeneityが高い反面、男性異性愛および女性患者由来のものは分子型14d/f、かつマクロライド耐性型であるものがほとんどを占めることが見出され、日本で2015年以降、梅毒報告数増加の主要因となっている男性異性愛および女性患者での増加がクローナルな株によるものである可能性が提起され、英文誌上で報告した。
この初年度で、信頼性の高いゲノムシーケンスデータを得る必要条件を見出せたが、使用する試薬のコスト面を考えると、特にAgilent の「Sure Select Target Enrichment System」を使用する直前段階において、最終的に信頼性の高いデータを得るための十分条件を見極める方法を模索することが肝要である。シーケンスデータ、型別結果と患者の性指向との連関性は疫学的に重要で今後とも、よりファインな、ゲノムシーケンスデータでの裏打ちによって今回見出された傾向が今後も継続するのかをサーベーランス的に行う必要性がある。シーケンスデータの情報を基にしたより分解能の高い簡易な分子型別改良法開発については、各国の幅広い多数株を単一プロジェクトで同時解析したグループの報告に先行された。この方法を試行し、特に特定型に集中する傾向が強いことがわかった日本の男性異性愛および女性患者由来株を細分化することが可能かを今後検討することが必要となった。
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