| 研究課題/領域番号 |
18K09227
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
澤田 健二郎 大阪大学, 医学系研究科, 講師 (00452392)
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| 研究分担者 |
馬淵 誠士 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (00452441)
小玉 美智子 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (70791391)
木村 正 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (90240845)
橋本 香映 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (90612078)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 卵巣癌 / マイクロRNA / エクソソーム / バイオマーカー / miR-99a-5p / miR-1290 |
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| 研究実績の概要 |
microRNA (miRNA) は血中に安定して存在しており、近年血中 miRNA のバイオマーカーとしての可能性が着目されている。miRNA が安定して存在している要因の一つは miRNA が血中では細胞が分泌するエクソソームなどの中に存在するからである。そのため、平成30年度はexosomal miRNA は卵巣がんの新規バイオマーカーになる可能性を秘めていると考え、卵巣癌細胞株より抽出したエクソソーム中の miRNA の網羅的解析を行った。具体的には漿液性腺癌細胞株であるHeyA-8 及びTYK-nu より RNA を抽出し、Agilent 2100でこのExosomal miRNA の多くが、500bp以下のsmall RNAであることを確認したうえで、両がん細胞株に含まれるmiRNA の網羅的解析をGeneChip miRNA 4.0 Array (Affymetrix社) で行った。対照として、正常卵巣上皮を不死化させた細胞株IOSEより抽出したエクソソームを用いた。解析の結果、卵巣がん細胞株の exosomal miRNA に高発現する miR-99a-5p とmiR-1290 を見出した。そこで、当科で治療を行った卵巣癌患者62名の血清を用いて、この miRNA が正常患者、良性卵巣腫瘍患者に比べて有意に高発現していることを証明した。さらに卵巣がん細胞が放出するexosomal miR-99a-5p をがん浸潤の際に周辺の腹膜中皮細胞に伝達されることにより、がんが浸潤しやすい環境を提供していることを証明した（BMC Cancer. 2018;18:1065）。さらに血清中の miR-1290が高異型度漿液性腺癌の患者血清に特異的に高発現しており、新たなバイオマーカーとしての可能性があることを報告した (J Ovarian Res. 2018;11:81)。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究計画で「本研究で何をどのように、どこまで明らかにしようとするのか？」の問いに対して、立案したのは以下の3つである。
① 卵巣がんが特異的に放出するexosomal miRNAの同定
② Exosomal miRNAの腫瘍マーカーとしての可能性の検討
③ エクソソームのDDS (Drug delivery system) におけるCarrier としての可能性の検討
である。上述したように、①と②に関しては一定の成果が出ており、論文をすでに2本発表済みである。従って、研究計画は順調に遂行していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
以下の手順で研究を推進していく。まずは線維芽細胞の初代培養を行う。具体的には手術時に採取した大網を用いて、はさみで細切後、コラゲナーゼ処理で腹膜中皮細胞を取り除いたのちに、トリプシン処方を行いことにより、線維芽細胞を摘出する。さらに初代培養線維芽細胞よりのエクソソームの抽出を行う。ショ糖密度勾配遠心法を用いて、純度の高いエクソソームの抽出に取り組む。
続いて、エクソソームへのmiR-199a-3p およびMet siRNA の封入を試みる。外注で作成したsmall RNA を電気穿孔法で作成した線維芽細胞由来のエクソソームに封入する。具体的には1μgのSmall RNAを1x109 個のエクソソームに大阪大学医学部共同研に設置しているGene Pulser Xcell PCシステム（Biorad）を用いて封入する。
さらに作成した“合成エクソソーム”を用いた卵巣がん細胞に対するIn vitro 実験を行う。“治療用エクソソーム”を蛍光色素PKH26（Sigma）で標識したうえで卵巣がん細胞株に添加し、その取り込みを共焦点蛍光顕微鏡で確認する。取り込みが確認できれば、Western blot 法でMet など標的分子の発現抑制ができているか確認する。その確認ができれば、この“治療用エクソソーム”の卵巣がん細胞の浸潤能、増殖能に与える影響をIn Vitro の実験系で検証する。
以上の検討を経て、最終的には卵巣がん腹膜播種モデルマウスに対する“合成エクソソーム”の治療効果の検討する。1x106個のSKOV3細胞を免疫不全マウスBalb-c nu/nuに腹腔内移植する。腹腔内移植後10日目に“合成エクソソーム”投与を開始する。コントロール群が末期症状と呈する21日目にマウスを安楽死させ、総腫瘍重量、播種数、腹水量を検討する。
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