| 研究課題/領域番号 |
18K09279
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
古田 伊都子 北海道大学, 医学研究院, 助手 (70238682)
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| 研究分担者 |
馬詰 武 北海道大学, 大学病院, 助教 (00807935)
水上 尚典 北海道大学, 医学研究院, 名誉教授 (40102256)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 妊娠高血圧腎症 / 尿中バイオマーカー |
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| 研究実績の概要 |
妊娠高血圧腎症(preeclampsia:PE)の患者では，腎糸球体上皮細胞であるpodocyteが尿中に多数検出される．本研究ではpodocyte関連物質を中心に，尿中においてタンパク尿出現以前に変動する物質を探索し，PE発症を予知する尿中バイオマーカーとしての有用性を検討する．
2018年度は，主に妊娠婦人から尿・血液検体の採取・保存を行い，並行して尿中のバイオマーカー候補物質の妊娠週数に伴う変動を検討した． 2016年から開始した先行研究で採取した検体と合わせると，妊娠中期の尿検体約180例，血液検体約100例を採取・保存できた．また，妊娠週数に伴う変動を検討する検体として15症例から妊娠初期・中期・後期の尿検体を経時的に採取することができた．
本研究ではpodocyte 関連タンパクとしてnephrinを，また腎臓においてrenin-angiotensin系(RAS)が活性化するとpodocyteが障害されることからRAS因子であるangiotensinogen(AGT)， angiotensin II (Ang II), angiotensin converting enzyme 2(ACE2)を候補タンパクとして予定している. 尿中 nephrin濃度はすでに予備実験で妊娠初期～後期まで変動がないことを確認している．また，尿中Ang II濃度は，妊娠初期より中期・後期で上昇することが文献で報告されている．今年度はAGTとACE2について妊娠に伴う尿中濃度の変動を検討した．その結果，尿中AGT濃度（ng/mg Cr：中央値，範囲）は妊娠初期(2.38, 0.14- 67.08)，中期(7.21, 0.22 - 179.84)，後期(43.82, 1.66 -390.12)と妊娠に伴って有意に上昇した．尿中ACE2濃度は妊娠期間中有意な変動が認められなかった．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では，妊娠中期婦人から尿および血液を採取し，妊娠高血圧腎症(preeclampsia:PE)発症と非発症群における尿中バイオマーカー候補物質濃度を比較してPE発症予知の有効性を検討するとともに先行研究が進んでいる血中sFlt-1/PlGF比の有効性と比較する．初年度は尿・血液検体の採取・保存と尿中のバイオマーカー候補物質の妊娠週数に伴う変動の検討を予定していた．本研究において3年間に採取する予定検体数は約300例であるが，本年度採取した検体数は2016年から開始した先行研究で採取した検体と合わせると，尿検体約180例，血液検体約100例であり，おおむね順調に進展している．ただ，採取した検体の中には本態性高血圧患者，双胎，妊娠合併症を有する等不適当症例も含まれるので，次年度以降も引き続き検体の採取を行って症例数増やしていく予定である．
また，初年度は尿中バイオマーカー候補物質の妊娠週数に伴う変動の検討を行う予定であったが，renin-angiotensin系因子であるangiotensinogen(AGT)，angiotensin converting enzyme 2(ACE2)の妊娠初期・中期・後期の尿中濃度を測定し，その変動を調べた．その結果，AGTは妊娠に伴って尿中濃度が上昇，ACE2では変動が認められないことが明らかになった．
本研究では，各種尿中バイオマーカー候補物質の測定を外注ではなく，測定kitを購入して行う．測定kitのLot間の差異や測定間のぶれを最小限にするために， PE発症と非発症群を比較する検討は測定検体，特に妊娠転帰が判明してPE症例と診断された検体がある程度採取された次年度以降に行う予定である．
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| 今後の研究の推進方策 |
2019年度以降も引き続き予定検体数（約300例，PE症例は13～15例を想定）に到達するまで妊娠中期の尿・血液検体の採取・保存を行う．
妊娠転帰が確定した保存検体について漸次尿中バイオマーカー候補物質（nephrin, AGT，Ang II，ACE2, PlGF），および血清sFlit-1, PlGFを測定する．各候補物質についてROC解析を行いPE発症予知の有用性を検討し，血清sFlit-1/PlGF比の有用性と比較する．
2019年度以降不死化ヒトpodocyte株細胞を用いたPE発症予知の可能性のある未知タンパクの探索実験を開始する．2019年度には，まずその予備実験として不死化ヒトpodocyte株細胞の最適培養条件を検討する．不死化ヒトpodocyte株細胞は継代数が増えるとその特異的遺伝子であるpodocin, nephrinの発現が減少・消失する．譲受された不死化ヒトpodocyte株細胞ではpodocinの発現が消失, nephrinの発現が減少していたので，これらの遺伝子発現が増加するような培養条件を検討する．最適な培養条件が決まった後，不死化ヒトpodocyte細胞を妊婦血清（PE発症例の発症前に採取した血清）添加培養液で培養し，培養液中に出現してくるpodocyte由来タンパクを探索する．方法としては，PE発症妊婦血清添加培養液（妊婦血清由来成分），標準培養液で培養した不死化ヒトpodocyte細胞の培養上清（細胞由来成分），PE発症妊婦血清添加培養液でpodocyte細胞を培養した培養上清（妊婦血清由来成分+細胞由来成分+妊婦血清添加刺激により生じる成分）をiTRAQ法で網羅的に比較定量解析し，妊婦血清添加培養液で培養した時の培養上清にのみ出現あるいは増加するタンパクを検出，同定する．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2018年度は，概ね研究実施計画書に沿った物品（検体保存用の容器，チップ等プラスチック消耗品，尿中バイオマーカー候補物質の測定kit，細胞培養用の培養液，supplement等）を購入した．また，open access journalへ論文を投稿した．次年度は高額な外注検査を予定しているので，再検査等不測の事態を考慮して本年度の支出を抑えたため当該年度の未使用額は225520円となった．
使用計画
次年度は尿中バイオマーカー候補物質の測定kitを購入しPE発症と非発症群を比較する検討する予定である．また，不死化ヒトpodocyte株細胞の培養上清中のタンパクをiTRAQ法で網羅的に比較定量解析する予定であるが，iTRAQ試薬を用いるこの解析は次世代の四重極飛行時間型システムを有するLC/MS/MS装置で行うため，かなり高額な外注検査となる．
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