| 研究課題/領域番号 |
18K09318
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
大西 弘恵 京都大学, 医学研究科, 研究員 (50397634)
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| 研究分担者 |
石川 正昭 京都大学, 医学研究科, 客員研究員 (10813743)
中川 隆之 京都大学, 医学研究科, 講師 (50335270)
宮本 達雄 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 准教授 (40452627)
山本 典生 京都大学, 医学研究科, 講師 (70378644)
田浦 晶子 藍野大学, 医療保健学部, 教授 (70515345)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 分化誘導 / 内耳感覚上皮細胞 / 蝸牛 / 前庭 / トランスクリプトーム解析 / ヒトiPS細胞 / ゲノム編集 |
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| 研究実績の概要 |
難聴研究において、難聴発症メカニズムの解析や治療効果を検討するためのヒト蝸牛感覚上皮モデルは大変重要であるがその作製方法はまだ確立されていない。そこで本研究ではヒトiPS細胞から蝸牛感覚上皮細胞を分化誘導する方法を確立するため、蝸牛感覚上皮発生にかかわる遺伝子や情報伝達系を同定、検討し、蝸牛感覚上皮発生機序の解明を目指す。続いて、ヒトiPS細胞由来内耳前駆細胞から有毛細胞への誘導過程において蝸牛化因子候補を調節することにより、遺伝子解析結果を検証するとともに蝸牛型の感覚上皮誘導法を確立する。平成30年度の研究計画は、①「蝸牛感覚上皮発生に特有な遺伝子の同定」であり、内耳各部位からマイクロアレイに用いるRNAの調整法の確立のための組織採取法などの検討を行った。また平成31年度以降に行うはずであった②「遺伝子発現解析結果の検証と蝸牛型感覚上皮誘導法の確立」に必要な検証を行った。内耳有毛細胞の分化誘導法の改良は時間がかかる為、前倒しで本年度から開始した。内耳有毛細胞マーカーであるATOH1が発現するとGFPが発現するレポーターヒトiPS細胞株を作製していたため、これを用いて内耳有毛細胞誘導法の検討を行った。まず野生型ヒトiPS細胞からKoehlerらが2017年に報告したヒト内耳オルガノイドの誘導法の再現実験を行い、SOX2+前庭型有毛細胞を多数含む内耳オルガノイドの誘導に成功した。続いてATOH1-GFPヒトiPS細胞から内耳オルガノイドの誘導を行い、GFP陽性の細胞集団を観察した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
①「蝸牛感覚上皮発生に特有な遺伝子の同定」を平成30年度に行う予定であり、耳包形成(E10)から有毛細胞形成まで(E16)の各日齢の周辺組織を含むマウス内耳組織切片を作成する。前庭・蝸牛感覚上皮予定領域（時期によっては感覚上皮領域）、および、周辺組織で誘導因子が産生されている可能性を考慮して内耳の外側の間質部位をレーザーマイクロダイセクション等によって回収しRNAを抽出し、マイクロアレイによる発現解析を行う予定であったが、マイクロアレイに用いるRNAの調製法の確立に手間取り、組織調整法の検討までにおわっている。その分、②「遺伝子発現解析結果の検証と蝸牛型感覚上皮誘導法の確立」の検討に時間がかかると思われるヒトiPS細胞からの内耳有毛細胞誘導法の検証を行い、蝸牛型感覚上皮の誘導法検証の土台となる誘導法の導入に成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き①「蝸牛感覚上皮発生に特有な遺伝子の同定」に必要な発生の各過程での内耳組織からのRNA抽出法の確立を行い、マイクロアレイ解析を行い、蝸牛化候補遺伝子の選出を行う。また昨今の遺伝子発現データーベースの充実に伴いバイオインフォマティクス解析による目的遺伝子候補の探索も可能と思われるため、これらの方法も候補遺伝子抽出に併用する予定である。②「遺伝子発現解析結果の検証と蝸牛型感覚上皮誘導法の確立」に必要な候補遺伝子発現iPS細胞作製のためのゲノム編集技術やAAVなどを用いたTet発現誘導システムや、siRNA導入システムづくりも同時に行いより早期にヒトiPS細胞由来蝸牛型有毛細胞が得られるよう努める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
「蝸牛感覚上皮発生に特有な遺伝子の同定」を平成30年度に行う予定であり、耳包形成から有毛細胞形成までの各日齢の周辺組織を含むマウス内耳組織切片を作成する。前庭・蝸牛感覚上皮予定領域（時期によっては感覚上皮領域）、および、周辺組織で誘導因子が産生されている可能性を考慮して内耳の外側の間質部位をレーザーマイクロダイセクション等によって回収しマイクロアレイによる発現解析を行う予定であったが、マイクロアレイに用いるRNAの調製法の確立に手間取り、組織調整法の検討までにおわった。昨年度使用できなかったRNA調製やマイクロアレイにかかる費用は次年度に執行し、目的とする遺伝子候補の同定を行う予定である。
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