| 研究課題/領域番号 |
18K09319
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
勝沼 紗矢香 神戸大学, 医学研究科, 医学研究員 (80457043)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 聴覚上皮 / 接着分子 / 有毛細胞 |
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| 研究実績の概要 |
感覚上皮は、機能の異なる感覚細胞と支持細胞の2種類の細胞から構成され、感覚細胞は支持細胞に囲まれて互いに接することなく並ぶ。申請者らは、感覚上皮においてこれら2種類の細胞が正しく配列する機序を報告したが（Katsunuma, et al. 2016. Togashi, et al. 2011）、この配列が機能に果たす役割は分かっていない。申請者らは、きこえを担う聴覚上皮で、異常に接した有毛細胞（感覚細胞）がみられるネクチンノックアウト（以下KO）マウスを報告しており、このKOマウスが難聴を示し、異常に接した有毛細胞のみが成長とともにアポトーシスにより失われていくことを明らかにしている（未発表）。ネクチンは主要な接着分子のひとつで、有毛細胞と支持細胞に各々異なるネクチンが発現することによって、両細胞間に接着親和性と接着力の違いが生じて細胞配列が形成される。このため、ネクチンKOマウス聴覚上皮において、有毛細胞どうしの異常な接着自体がアポトーシスを惹起していると仮定した。そこで、聴覚上皮細胞間における接着分子およびその構成分子の集積を、成長を追って観察したところ、野生型ではこれら分子の細胞間における濃縮が変化するのに対し、KOマウスでは有毛細胞と支持細胞間における濃縮に変化がみられなかった。野生型でこれら分子の細胞間濃縮が変化する時期と、KOマウスにおける有毛細胞がアポトーシスを生じる時期を照らし合わせた結果、有毛細胞どうしの異常な接着自体がアポトーシスを惹起し、聴覚上皮の細胞配列自体が有毛細胞の生存に重要である可能性が考えられた。聴覚上皮細胞配列における、支持細胞のはたらきをとおした有毛細胞の維持ときこえのしくみを解明することは、感覚器共通の感覚受容機構を解明するとともに、聴覚障害治療に対する新しい治療戦略を提供できる可能性があり、本研究をすすめていく意義があると考える。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまで申請者らは、きこえを担う聴覚上皮で、異常に接した有毛細胞が観察されるネクチンKOマウスを報告しており（Togashi, et al. 2011）、このマウスが難聴を示し、異常に接した有毛細胞のみが生後成長とともにアポトーシスにより失われていくことを明らかにしている（未発表）。ネクチンKOマウス聴覚上皮において、有毛細胞どうしの異常な接着自体がアポトーシスの契機となるのではないかと仮定し、聴覚上皮の細胞間接着におけるTight junction形成分子ZO-1の集積を観察したところ、野生型と比較してネクチンKOマウスでは、有毛細胞と支持細胞間のZO-1の濃縮が成長しても強いまま変化しないことがわかった。続いて、野生型マウス聴覚上皮において、成長のどの段階で、有毛細胞と支持細胞の間のZO-1の集積が変化するのかを蛍光免疫染色で観察した。さらに、野生型マウス及びネクチンKOマウス聴覚上皮の成長過程において、接着分子の細胞内結合蛋白であるアファディン、カテニンの細胞境界における濃縮がどのように変化するのかを蛍光免疫染色で観察した。以上の観察で得られた、野生型マウス聴覚上皮で細胞間接着構成分子の細胞間濃縮に変化が生じる時期と、これまで観察してきたネクチンKOマウス聴覚上皮において異常に接着した有毛細胞がアポトーシスをおこす時期を照らし合わせたところ、有毛細胞どうしの異常な接着自体がアポトーシスの契機となることが示唆された。以上より、聴覚上皮の細胞配列自体が有毛細胞の生存に重要である可能性が考えられ、今後、次に述べる実験を計画している。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまで申請者らは、異常に接した有毛細胞が観察される接着分子ネクチンKOマウスを報告しており（Togashi, et al. 2011）、このマウスが難聴を示し、異常に接した有毛細胞のみが生後成長とともにアポトーシスにより失われていくことを明らかにしている（未発表）。ネクチンKOマウスにおいて、有毛細胞どうしの異常な接着自体がアポトーシスの契機となるのではないかと仮定し、野生型マウス及びネクチンKOマウス聴覚上皮の成長過程を比較したところ、細胞間接着構成分子の細胞境界における濃縮の経時的変化が異なっており、有毛細胞どうしの異常な接着自体がアポトーシスの契機となる可能性が考えられた。そこで現在、KOマウス聴覚上皮における異常に接した有毛細胞がどのようなアポトーシス経路をたどるのか明らかにするために、聴覚上皮からｍRNAを抽出しリアルタイムPCRでアポトーシス経路の候補を探索している。候補を同定したのちは、蛍光免疫染色及び蛋白発現解析にてアポトーシス経路を明らかにする。続いて、KOマウス有毛細胞間の異常な接着がアポトーシスを惹起している可能性をさらに検証するために、マウス聴覚上皮を摘出、トリプシン処理にて細胞を単離培養することで、有毛細胞どうしの接着を解消し、支持細胞との接触の有無が関与しない環境下において、KOマウス有毛細胞の細胞死が抑制されるかを観察する。また、単離有毛細胞に音響を与えてその機能（音響で電気的興奮が生じると有毛細胞が収縮する）を測定する。さらに有毛細胞のみを培養した場合と、支持細胞と共培養した場合を比較検討し、支持細胞の有毛細胞の生存と機能に対する効果を解析する。以上の実験検証より、ネクチンKOマウス有毛細胞がアポトーシスにて脱落する原因を特定し、聴覚上皮細胞配列における、有毛細胞の維持ときこえのしくみを解明する。
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