| 研究課題/領域番号 |
18K09358
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
野村 泰之 日本大学, 医学部, 講師 (20297815)
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| 研究分担者 |
日だい 智明 日本大学, 医学部, 准教授 (70228732)
弓削 類 広島大学, 医歯薬保健学研究科(保), 教授 (20263676)
村上 正人 日本大学, 医学部, 客員教授 (60142501)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 線維筋痛症 / エクソソーム / オートファジー / Beclin-1 / Caspase-3 |
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| 研究実績の概要 |
我々の研究チームは、内耳培養細胞HEI-OC1を小胞体ストレス処理(ツニカマイシン)負荷した場合、小胞体ストレス応答因子XBP1とオートファジー誘導マーカーLC3-IIが誘導されること、XBP1ノックダウン(KD)HEI-OC1細胞をツニカマイシン負荷処理した際には内耳細胞のオートファジー誘導能が低下することも確認した。また、XBP1 mRNAスプライシングが内耳細胞のオートファジー誘導に大きく関わり、内耳細胞保護作用を持つことをすでに明らかにしている。
今年度、オートファジー関連タンパク質Beclin-1をノックダウンした内耳培養細胞HEI-OC1を小胞体ストレス誘導剤（ツニカマイシン）負荷した場合、アポトーシス誘導タンパク質cleaved-Caspase-3が時間依存性に誘導され、細胞生存率が有意に低下したことを確認した。この結果は、内耳感覚細胞においてBeclin-1とCaspase-3を介してオートファジーとアポトーシス間にはクロストークが存在する可能性を示唆する極めて興味深い結果である。
また、内耳培養細胞HEI-OC1を線維筋痛症モデルとして用いる寒冷刺激においても誘導される可能性のあるmiRNA let-7bで処理した場合、細胞生存率は時間依存性に低下し、細胞興奮マーカーp-ERKは時間依存性に誘導された。この結果は、中枢神経細胞死により分泌されたmiRNA let-7bが、疼痛刺激による細胞興奮を伴いつつ内耳機能を低下させる可能性を示唆する極めて興味深い結果である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
前述したように、小胞体ストレス下の内耳感覚細胞において、Beclin-1とCaspase-3を介してのオートファジーとアポトーシス間クロストークが存在する可能性を示唆する極めて興味深い結果と、線維筋痛症モデルとして用いる寒冷刺激にても誘導され、実際には中枢神経細胞死によっても分泌されるエクソソーム内miRNA let-7bで内耳細胞を曝露した場合に、疼痛刺激による細胞興奮を伴いつつ内耳機能を低下させる可能性を示唆する極めて興味深い結果を得ている。これらの結果は、線維筋痛症in vitroモデルを作成する上で極めて重要な結果である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度は、昨年度内耳培養細胞で行った実験結果を元にして、同じ条件にて、SGN培養細胞と神経細胞を処理し、XBP1介在小胞体ストレス誘導性オートファジーによる細胞死・興奮シグナル伝達に関する検討を行う。 このデータを元にして低温ストレスをミクログリア細胞(株化細胞BV-2)に連続負荷して活性化ミクログリア細胞モデルを作製し、傷害性および保護性の活性化ミクログリア内在性因子をタンパク質レベルでの発現をwestern blotにより確認する。そしてエクソソームを単離し、エクソソーム内miRNAのプロファイリングを行い、内耳細胞、神経細胞の細胞死・興奮に関わる特異的miRNAを抽出することを目標とする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究の進捗により、エクソソームに介在されるmicroRNAの検証をおこなう試薬など（microRNA導入キット 10200円x2、microRNA let-7b 52000円x2、let-7bインヒビター 53000円x2、核タンパク質・細胞質タンパク質抽出キット 62000円x2、細胞膜タンパク質抽出キット53000円x2、Western blot 試薬:80000円x3、等）の購入が必要となってきたために次年度使用額が生じた。
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