| 研究課題/領域番号 |
18K09358
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
野村 泰之 日本大学, 医学部, 講師 (20297815)
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| 研究分担者 |
日だい 智明 日本大学, 医学部, 教授 (70228732)
弓削 類 広島大学, 医系科学研究科(保), 教授 (20263676)
村上 正人 日本大学, 医学部, 兼任講師 (60142501)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 線維筋痛症 / オートファジー / necroptosis / 前庭細胞 / 小胞体ストレス |
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| 研究実績の概要 |
我々は、内耳感覚細胞HEI-OC1を小胞体ストレス誘導剤ツニカマイシン (TM)処理すると、necroptosisがapoptosisのバックアップのための細胞死制御機構として誘導されることを報告した（Int. J. Mol. Sci. 2019）。
次に、我々はcaspase-8が、necroptosisとapoptosisのリンクに重要な役割を果たしているという報告に着目し、小胞体ストレス誘導下における内耳感覚細胞におけるcaspase-8とRIPK1との相互作用に重点を置いた評価を行った。
さらに我々はcaspase-9がcaspase-3とリンクしapoptosisを誘導することに着目し、小胞体ストレス誘導下における内耳感覚細胞におけるcaspase-9の機能評価を行った。
これらの小胞体ストレス下における内耳感覚細胞のシグナル伝達のデータを元にして、我々は小胞体ストレス誘導下における前庭上皮細胞UB/UE-1から分泌されるエクソソームの機能評価を行い、ツニカマイシン処理した前庭上皮細胞の細胞生存率は、時間・濃度依存性に低下し、cleaved caspase-3の発現増加よりアポトーシス、LC3-Ⅱとp62の発現増加よりオートファジーの誘導を確認した。ツニカマイシン処理前庭上皮細胞由来エクソソームを未処理細胞に曝露すると細胞生存率は時間依存性に低下したことを確認した。この結果は、小胞体ストレス処理前庭上皮細胞より分泌されるエクソソームは、細胞間の細胞死誘導に深く関与することを示唆している。内耳感覚細胞HEI-OC1、前庭上皮細胞UB/UE-1をもとに引き続き機序の解明をおこなっている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
前述したように、小胞体ストレス下の内耳感覚細胞において、necroptosisはapoptosisのバックアップとして誘導され、RIPK1, RIPK3, MLKL1が複合体を形成し、necroptosis誘導に重要な役割を果たし、caspase-9がcaspase-3とリンクしapoptosisを誘導することを確認した。この結果は、小胞体ストレス誘導下における細胞死制御には、apoptosisのみならずnecroptosis制御が必要であることを実験的に証明した点で、非常に価値のある結果を得た。
さらに今回、小胞体ストレス下の前庭培養細胞UB/UE-1から分泌されるエクソソームは、apoptosisとautophagyを誘導する可能性が示唆される結果を得た。また、内耳培養細胞HEI-OC1とは、細胞生存率の観点から小胞体ストレス応答が異なる可能性を示唆する極めて興味深い結果を得ている。これらの結果は、蝸牛・前庭症状を有する線維筋痛症in vitroモデルを作成する上で極めて重要な結果である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度は、昨年度の実験結果を元にして、同じ条件にて、前庭細胞UB/UE-1を処理し、XBP1介在小胞体ストレス誘導性オートファジーによる細胞死・興奮シグナル伝達に関する検討を行う。その同じ培地からエクソソームを単離し、エクソソーム内miRNAのプロファイリングを行い、内耳細胞、前庭細胞の細胞死・興奮に関わる特異的miRNAを抽出する。これらのエクソソームmiRNAを神経初代培養細胞に付加し、かつ低温ストレスをミクログリア細胞(株化細胞BV-2)に連続負荷して、活性化ミクログリア細胞モデルを作製する(11:Ni J. J Neurosci.2015)。このエクソソームmiRNA処理神経初代培養細胞と活性化ミクログリアからmRNAを抽出しRNAseqを行い、蝸牛・前庭症状を伴う線維筋痛症in vitroモデルにおけるバイオマーカーを網羅解析することを目的とする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
少額の次年度使用が生じたが、研究計画自体は、順調に推移している。研究使用は、XBP1介在小胞体ストレス誘導性オートファジーによる細胞死・興奮シグナル伝達に関する抗体と、ターゲット分子をノックダウンするためのsiRNA、エクソソーム抽出キットと受託サービス、miRNAのプロファイリング、RNAseq解析に使用する予定である。
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