| 研究課題/領域番号 |
18K09401
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| 研究機関 | 浜松医科大学 |
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研究代表者 |
大石 健太郎 浜松医科大学, 光尖端医学教育研究センター, 助教 (80345826)
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| 研究分担者 |
大坪 正史 浜松医科大学, 光尖端医学教育研究センター, 助教 (10327653)
尾花 明 浜松医科大学, 光尖端医学教育研究センター, 客員教授 (40194625)
堀田 喜裕 浜松医科大学, 医学部, 教授 (90173608)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | クローニング / cDNAライブラリー / 免疫沈降 / 免疫細胞染色 / 強制発現 |
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| 研究実績の概要 |
2018年度は、Gatewayシステムを用いた遺伝子クローニングを実施した。
PANK4遺伝子とそれと相互作用するタンパク質の遺伝子のcDNAをヒトcDNAライブラリーから抽出し、ドナーベクターへのクローニングを実施した。そして、そのコンストラクトに対して種々の改変を加え、目的別の様々なタイプのPANK4-コンストラクト（エントリークローン）を構築した。また、このライブラリー由来のcDNAの塩基配列を調べたところ、アミノ酸置換変異が１ヶ所存在していたため、公共データベースに登録されている塩基に置換することで、修正した。このコンストラクトに、真核細胞と原核細胞のリボソーム呼び込みモチーフであるコザック／SD配列をN末に導入し、完全なエントリークローンとした。最終的に、全部で5種類のエントリークローンを作製した。
その後、哺乳類細胞発現用のデスティネーションベクターに移し、培養細胞に形質導入および強制発現させ、この細胞が目的通りのタンパク質を生成するかについて検討した。蛍光免疫染色における特異抗体の反応性から、目的通りのタンパク質が生成されていることが明らかとなった。
大腸菌発現用のデスティネーションベクターに移し、大腸菌に形質導入することでタンパク質を強制発現させた。これにより、正常にタンパク質生成するかについて、免疫沈降法などにより検討した。
加齢黄斑変性（AMD）の患者と非AMD患者の血液検体は123人分を収集した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
実験自体はスムーズに進んでいるが、途中でPANK4に関して大腸菌がコロニーを形成しなかったため、クローニングが進まず、この問題の解決に時間がかかったことが、遅れている原因の一つである。しかし、作製するコンストラクト数が多かったこと、追加の配列導入や変異導入などの手間が多かったことも、遅れた要員である。
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| 今後の研究の推進方策 |
CRISPR/Cas9システムを用いて遺伝子組換え動物を作製する。
酵素活性測定システムの構築し、遺伝子特性を調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は遺伝子クローニングとそのコンストラクトへの目的別のタグ配列の挿入や変異導入による多数のコンストラクト作製に時間がかかり、ゲノム編集実験に進めなかった。また、コンストラクトができなかったために、培養細胞でのタンパク質作製まで進めなかったため、他の実験にも進められなかった。
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